Болезни и вредители пчел - часть 11

приготовления убитого кипячением антигена, вторую — для по-

лучения автоклавированного антигена.

Проводят титрование выделенных бактерий по О-антигену

с целью установления энзоотических серотипов при помощи

набора типоспецифических агглютинирующих сывороток. Если

культура Е.

 серологически не типируется набором О-сыворо-

ток, используют другие диагностические сыворотки.

В том случае, когда из гемолимфы выделены бактерии

Э. коли, которые не типируются серологически набором типоспе-

цифических колисывороток, необходимо определить патогенные

свойства кишечной палочки путем постановки биологической

пробы на пчелах. С этой целью используют 2 садка с пчелами (по

100 штук в каждом). Пчел первого садка (контрольный) кормят

сахарным сиропом (1:1), пчел второго садка (опытный)

харным сиропом с культурой Э. коли (1 млрд. клеток в 1 мл).

Пчел в садках содержат 10 дней при температуре 30

 ежеднев-

но подсчитывая погибших насекомых. Культуру признают пато-

генной, если наблюдаются признаки болезни у опытных пчел

(вздутие брюшка, пятна экскрементов на стенке садка) и про-

должительность жизни у них сокращается более чем в 2 раза по

сравнению с продолжительностью жизни контрольных пчел.

Положительный диагноз на колибактериоз устанавливают

при выделении из гемолимфы пчел культуры Е. coli и если она

серологически типируется набором типоспецифических колисыво-

роток или не типируется, но вызывает гибель пчел.

Определяют чувствительность выделенных патогенных ки-

шечных палочек к антибиотикам и химиотерапевтическим препа-

ратам, руководствуясь методикой, описанной ниже, для всех

возбудителей.

АСКОСФЕРОЗ. Для микроскопического исследования ис-

пользуют соскоб с поверхности тела пораженных личинок. Не-

большое количество полученного материала помещают на пред-

метное стекло в каплю 50

 водного раствора глицерина

или лактофенола (20 г кристаллического фенола, 16 мл молочной

кислоты и 31 мл глицерина) и рассматривают при малом увеличе-

нии микроскопа с целью обнаружения мицелия и плодовых тел

гриба.

Для подтверждения результатов микроскопического иссле-

дования из патматериала выделяют чистую культуру гриба. Для

этого трупы личинок извлекают из ячеек, помещают в стерильную

пробирку с 2 мл физраствора, вносят туда же 1000 ЕД пеницилли-

на и 1000 ЕД стрептомицина, тщательно растирают и материал

высевают на скошенный сусло-агар или среду Сабуро в пробир-

ках. Посевы культивируют в течение 10 сут при температуре

 °С. На

 сут на поверхности среды появляются белые

пушистые колонии, дающие к

 сут зеленовато-серый налет

на дне и по краям колонии, который образуется при формирова-

нии плодовых тел гриба. Колонии могут остаться белыми в том

случае, если в пробирке будет развиваться мицелий лишь одного

80

 23. Споровая циста гриба

 apis с

заключенными в ней споровыми шарами. Увеличение

 (по А. Г. Григорян).

пола. Чистую культуру гриба получают путем пересева с перифе-

рии колоний, характерных для данного гриба.

Мицелий гриба состоит из многоклеточных гиф толщиной

4,2—12 мкм с многоядерными клетками, обладает половым ди-

морфизмом. Женский мицелий — белый, мужской — желтовато-

зеленоватый, в результате сложного полового процесса образу-

ются многочисленные одноклеточные споры диаметром

3,2 мкм, склеенные в шары (рис. 23). Плодовые тела диаметром

 мкм покрыты толстой оболочкой (рис. 24).

АСПЕРГИЛЛЕЗ. В лабораторию посылают трупы пчел (не

менее 50) и соты с погибшими личинками (ЗХ 15 см). Материал

посылают в стерильных банках с притертыми пробками.

При микроскопическом исследовании пчел и личинок по-

мещают в чашки Петри и просматривают под малым увеличением

для обнаружения на поверхности их тела характерного спороно-

шения гриба (конидиальные головки). Затем готовят препараты

для изучения гриба при большом увеличении. Делают соскобы

с поверхности погибших пчел и личинок, а также сотов и помеща-

ют их на предметное стекло в каплю из смеси спирта, воды

и глицерина (равные части), покрывают покровным стеклом

и исследуют на наличие гриба.

Для выделения культуры возбудителя кусочки трупов, а так-

же кишечника помещают в чашку Петри на агар Чапека. Для

предупреждения бактериального роста к среде добавляют

антибиотики (пенициллин — 50 ЕД/мл, стрептомицин —

100 ЕД/мл). Культивируют при температуре

 °С. Через

 дня появляются желто-зеленые колонии гриба

 flavus,

они мелкозернистые с воздушным мицелием по краям. Мицелий

белый или желтый с отходящими от него многочисленными кони-

81

Рис. 24. Культура

 apis на пятые сутки роста, мицелий и

 Увеличение  1000

диеносцами размером

 5-15 мкм, на конце которых

имеются округлые вздутия 10-40 мкм в диаметре. На вздутиях

образуются отходящие радиально одноярусные или двухъярус-

ные стеригмы с расположенными в виде цепочек конидиями раз-

мером 3—6 мкм в диаметре.

В

 из патматериала могут выделяться также Asper

 с темно-зелеными колониями, Asper.

 с черно-

коричневыми колониями и другие грибы.

МЕЛАНОЗ В ветеринарную лабораторию направляют тру-

пы маток в 50%-ном растворе глицерина. Присланных пчел

обрабатывают йодированным спиртом. Затем с соблюдением

стерильности проводят вскрытие (обнаруживают почернение

яичников и других внутренних органов) и готовят из пораженных

органов суспензию на стерильном физрастворе и препараты для

микроскопии. С этой целью на предметное стекло наносят каплю

 (20 г кристаллического фенола, 16 мл молочной

кислоты, 31 мл чистого глицерина), в нее вносят небольшой кусо-

чек пораженного органа и расщепляют его двумя препаровальны-

ми иглами на отдельные фрагменты. Препарат слегка подогрева-

ют на слабом огне, покрывают стеклом и рассматривают под

микроскопом при увеличении X

 200 и 400. В пораженных

органах в начале заболевания обнаруживают спороцисты —

округлые клетки гриба с коричневой цитоплазмой размером

82

 X 14,2 мкм, а в поздние сроки заболевания — черную зерни-

стую массу. У больных маток в яичниках обнаруживают большое

количество трубочек желтого, коричневого или черного цвета

в виде темных пятен (меланин), что является характерным при-

знаком болезни. Яичники здоровой матки белого цвета. При

меланозе также могут поражаться прямая кишка, ядовитые

железы, мышцы.

Выделение культуры гриба проводят путем высева суспензии

патматериала на сусло-агар, сливовый или картофельно-морков-

ный агар; оптимальная температура роста

 °С. Рост гриба

появляется на третьи сутки. Колонии возбудителя меланоза

сначала белые, гладкие, с возрастом темнеют и становятся черны-

ми, морщинистыми или бугристыми. В препаратах из культуры

гриба выявляются желто-коричневые гифы, овальные оидии и

темно-коричневые круглые или овальные хламидоспоры разме-

ром

 мкм, которые, прорастая, образуют псев-

домицелий и цепочки дрожжеподобных клеток.

В старых культурах часто образуются толстостенные темно-

окрашенные хламидоспоры. При их прорастании в зависимости

от питательной среды могут либо образовываться проростки,

дающие начало новым гифам, либо дрожжеподобные клетки.

Вначале они светлые, затем темнеют; их размеры

 X

 —

14,7 мкм. Хламидоспоры более

 мкм, как

правило, одноклеточные, реже с одной или двумя перегородками.

Грифы в поперечнике составляют от 1,5 до 6 мкм.

КАНДИДАМИКОЗ. В лабораторию направляют больных

и свежие трупы пчел, образцы сотов с медом и пергой с белой

блестящей поверхностью в ячейках. Мазки готовят из содержи-

мого зобика, средней кишки и мальпигиевых сосудов. Препараты

исследуют в темном поле зрения микроскопа на наличие дрожже-

подобных грибков — бластоспор и псевдомицелия.

Делают посев материала на бактериологические среды и го-

товят суспензию из

 свежих трупов или больных пчел от

одной семьи. В суспензию вносят биомицин, тетрациклин или

окситетрациклин (или антибиотик, который применяли на небла-

гополучной пасеке) и высевают на сусло-агар, кукурузный или

картофельный агар с глюкозой, агар Сабуро и в бульон с глюко-

зой. Посевы инкубируют при температуре

 в течение

10 дней. По культурально-морфологическим и биохимическим

свойствам соответственно определяют виды грибов рода Candida.

Candida albicans имеет вид гроздевидно расположенных

округлых клеток (бластоспор), псевдомицелия и шаровидных

клеток с двухконтурной светящейся оболочкой — хламидоспоры.

Они видны нередко в препаратах нативного материала и в препа-

ратах из колонии на кукурузном и рисовом агаре на

 сут.

Другие виды Candida хламидоспор не образуют.

Для С. albicans, С. tropicalis и С. krussei, выделенных от

теплокровных животных, птиц и пчел, характерна их способность

прорастать в глубь среды, что хорошо видно под изолированной

83

колонией на косом агаре на

 сут (после пересева изучаемой

культуры).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕ-

ЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ПЧЕЛ К АНТИБИОТИКАМ. Чувствитель-

ность выделенных микроорганизмов к антибиотикам определяют

методом бумажных дисков (метод диффузии в агар). Для этого

в стерильные чашки Петри наливают плотную питательную среду

(картофельный или мясо-пептонный агар, среды Бейли, Черепова

или Томашеца) и на ее поверхность наносят 1 мл густой буль-

онной культуры или смывы с агара. Покачивая чашку, равно-

мерно распределяют жидкость на поверхности среды. На засе-

янный агар накладывают пинцетом по одному бумажному диску

с антибиотиками — пенициллином, стрептомицином, биомицином

и др. На одной чашке можно испытать чувствительность микро-

бов к четырем антибиотикам. Чашки помещают в термостат на

 затем измеряют диаметр зон задержки роста микробов

вокруг дисков миллиметровой линейкой, которую накладывают

на дно чашки. Зона размером 15 мм — слабая чувствительность

микробов, зона более 24 мм — высокая чувствительность микро-

бов, зона меньше 15

 отсутствие чувствительности.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕ-

ЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ПЧЕЛ К СУЛЬФАНИЛАМИДНЫМ ПРЕПА-

РАТАМ. Используют метод диффузии, который заключается

в следующем. В стерильные чашки Петри наливают по 20 мл

расплавленной питательной среды (картофельного или мясо-

пептонного сывороточного агара). Из застывшей питательной

среды вырезают стерильным скальпелем полоску (по диаметру

чашки Петри) шириной в 1 см. В образовавшуюся канавку зали-

вают ту же среду с 0,4 %-ным раствором

 натрия,

или с 0,4 %-ным раствором сульфантрола. Заранее готовят сте-

рильный мясо-пептонный агар с сульфаниламидными препарата-

ми. Чашки помещают в термостат на

 ч для диффузии

сульфаниламидов в среду. Затем бульонную культуру 24-часово-

го роста испытуемых патогенных микробов вносят на поверхность

приготовленных питательных сред. Посев культуры проводят

в одну или две линии перпендикулярно к канавке. Результаты

роста культуры и бактерицидное действие сульфаниламидных

препаратов учитывают через 24, 48 и 72 ч после выдерживания

в термостате при температуре 37 °С. Устойчивые штаммы бакте-

рий растут до самой канавки и даже по ее поверхности. Чувстви-

тельные штаммы прекращают рост на некотором расстоянии от

нее или не растут на поверхности сульфаниламидной среды.

МЕТОДИКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ

КАЧЕСТВА ДЕЗИНФЕКЦИИ ОБЪЕКТОВ ПЧЕЛОВОДСТВА.

С целью обеспечения эффективности дезинфекции объектов на

пасеке после каждой их обработки обеззараживающими раство-

рами или газом ОКЭБМ необходимо проверить качество прове-

денной работы. Контроль качества дезинфекции осуществляют

бактериологическим методом путем выделения с поверхностей

84

обеззараживаемых объектов кишечной палочки лактозопозитив-

ной группы (Е.

 E.

 E. aerogenes) и стрептококка

пчелиного

 apis).

По наличию кишечной палочки определяют качество профи-

лактической и вынужденной дезинфекции при сальмонеллезе,

гафниозе, септицемии, вирусном параличе и мешотчатом распло-

де, нозематозе и маланозе пчел и маток.

Пробы с поверхностей обеззараживаемых объектов для

бактериологического исследования берут через 3 ч после проведе-

ния профилактической дезинфекции, а при вынужденной (на

неблагополучной пасеке) по истечении времени экспозиции, реко-

мендуемой при использовании соответствующих дезинфицирую-

щих средств. Пробы берут при помощи ватно-марлевых тампо-

нов, пропитанных нейтрализующим раствором. При использова-

нии для дезинфекции растворов едкого натра, каспоса,

кальцинированной соды и других щелочных препаратов в каче-

стве нейтрализующего раствора берут раствор уксусной кисло-

ты; при дезинфекции формалином и пароформом — раствор

нашатырного спирта; при дезинфекции щелочным раствором

формальдегида — смесь, состоящую из растворов уксусной кис-

лоты и нашатырного спирта; при дезинфекции раствором глута-

рового альдегида — раствор бисульфита натрия; при дезинфек-

ции перекисью водорода и хлорамином — раствор гипосульфита

натрия; при применении препарата дезинфектол — раствор ам-

миака. Нейтрализующие растворы используют в концентрации

в 10 раз меньшей, чем концентрация примененного дезинфектан-

та. При отсутствии нейтрализующего раствора используют обыч-

ную воду (стерильную).

Для бактериологического исследования качества дезинфек-

ции ульев пробы берут со дна со всех стенок улья, всего с пяти

различных мест (от 3 % обеззараженных ульев на пасеке).

С каждого вида пчеловодного инвентаря (дымарь, роевня, медо-

гонка, воскопресс) берут по одной пробе. Чтобы взять пробу,

намечают на ульях и оборудовании квадраты величиной

 X

 см и протирают их в течение

 мин стерильным ватно-

марлевым тампоном, пропитанным в колбе нейтрализующим

раствором и затем хорошо отжатым. Тампоны, каждый в отдель-

ности, помещают в колбы со стерильным нейтрализующим

раствором или стерильной водой (20 мл) и в таком виде доставля-

ют в лабораторию.

В каждой соторамке (в количестве 1 % от числа подвергну-

тых дезинфекции) с двух сторон отмечают бумажными флажками

два участка по 25 ячеек в каждом. Затем в каждую намеченную

ячейку сота вносят пипеткой по

 капель соответствующего

нейтрализующего раствора, после чего вращательными движени-

ями конца пастеровской пипетки отмывают микробные тела со

стенок и дна ячеек и вместе с нейтрализующим раствором отсасы-

вают и переносят в стерильные центрифужные пробирки, которые

закрывают резиновыми пробками. Пробы должны быть доставле-

85

ны в лабораторию не позднее чем через 2 ч после взятия. К про-

бам прикладывают сопроводительную, в которой указывают:

адрес хозяйства или владельца пасеки, дату, время дезинфекции

и взятия проб, должность лица, взявшего пробы для исследова-

ния.

В лаборатории пробы исследуют в день доставки. Для этого

тампон тщательно отжимают от нейтрализатора в той же колбе,

где он находился, и удаляют; жидкость помещают в стерильные

центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 30 мин при

 тыс. об/мин. Смывы с соторамок также центрифугируют.

Затем надосадочную жидкость осторожно сливают, к осадку

в пробирку наливают такое же количество стерильной воды,

содержимое смешивают и после 20-минутного центрифугирова-

ния снова удаляют надосадочную жидкость, а центрифугат

используют для бактериологических исследований. Осадок в объ-

еме 0,5 мл высевают в пробирки со скошенным агаром и в мясо-

пептонный бульон (5 мл). Посевы выдерживают в термостате при

температуре 37

 в течение 24 ч. Выросшие на питательных

средах микробные культуры кишечной палочки и стрептококка

пчелиного исследуют по общепринятой методике.

Качество дезинфекции признают удовлетворительным, если

в посевах из исследуемых проб нет роста указанных культур

микроорганизмов.

ИНВАЗИОННЫЕ БОЛЕЗНИ

Инвазионные (паразитарные) болезни медоносной пчелы

вызываются возбудителями различной природы: простейшими,

гельминтами, клещами и насекомыми, в связи с этим их разделя-

ют на четыре большие группы: протозоозы, гельминтозы, арахно-

 и

Из группы простейших рассматривается 7 болезней, из

числа которых более часто регистрируются болезни, вызываемые

микроспоридиями. Долгое время бытовало мнение, что болезнь

у медоносных пчел вызывает один вид микроспоридии —

apis Zander, 1909. Однако изучение цикла развития паразита,

сохраняемости спор во внешней среде, круга восприимчивых

хозяев, тканевой специфичности и мест локализации в хозяине,

отношения к лечебным препаратам и других вопросов дало проти-

воречивые данные. Было высказано предположение, что болезнь

вызывают 2 вида микроспоридий.

По характеру поражений микроспоридиями медоносных пчел

различают: микроспоридиозы взрослых пчел, вызываемые

ma apis и

 sp., характеризующиеся поражением

кишечника; диссеминированный нозематоз взрослых пчел, обус-

ловленный N.

 нозематоз доимагинальных форм развития

пчелы (N. sp. Buys, 1972).

НОЗЕМАТОЗ

 — болезнь взрослых пчел.

 Nosema apis Zander, 1909. Свежие

зрелые споры паразита овальной, яйцевидной формы размером

 X

 мкм. Оболочка спор гладкая или слегка вол-

нистая, трехслойная толщиной

 мкм. У одного края

споры тоньше и имеют микропиле 0,080 мкм диаметром и поляр-

ные гранулы. Внутри споры различают: зонтикоподобный

пластинчатый поляропласт; полярную трубку, свернутую в

34 витка, уложенные в два слоя

 25); спороплазму с двумя

сферическими или продолговатыми ядрами (иногда одно из них

больше другого, размер их

 мкм, расположены про-

дольно или несколько смещены к заднему концу споры); заднюю

вакуоль.

Заражение пчел возможно при температурах от

 до 37 °С.

Оптимум развития микроспоридий — 31 °С.

87