Болезни и вредители пчел - часть 10

Рис. 19. Споры Bacillus

 Сбоку спор видны

арфообразные

 тела. Увеличение

 А.

 Смирнову).

120 °С в течение часа, затем экстракт фильтруют через ватный

фильтр. Параллельно готовят смесь: 2 г растительного агар-

агара, 1 г пептона, 0,5 г натрия хлорида и 500 мл водопроводной

воды, которую стерилизуют текучим паром 30 мин. Затем к пече-

ночному экстракту добавляют равное количество указанной

смеси и после охлаждения до 60 °С устанавливают рН 7,0—7,2.

После этого печеночный агар-агар разливают по пробиркам или

колбам, стерилизуют автоклавированием при 120 °С в течение

30 мин.

На плотной среде колонии появляются через 24 ч после

посева, они

 мм в диаметре, с ровными краями, беловато-

серого цвета с голубоватым оттенком и металлическим блеском,

к 48 часам образуется пышное серовато-белое наложение. МПБ

в начале мутнеет, затем на дне образуется осадок и бульон про-

светляется. Желатину разжижает медленно, молоко коагулирует

с образованием плотного сгустка. Микроб ферментирует глюкозу,

мальтозу, маннозу, декстрозу, ксилозу, салицин и маннит с обра-

зованием кислоты, но без газа и не ферментирует сахарозу,

рамнозу, лактозу, галактозу, арабинозу, дульцит, сорбит, инозит

и адонит. Индола и сероводорода не образует, реакция с метилрот

отрицательная, реакция Фогес — Проскауэр положительная,

нитраты восстанавливает, на кровяном агаре образует гемолиз

типа

При проведении серологической диагностики ставят реакцию

преципитации (РП). Антигены для этой реакции готовят из

72

10 трупов пораженных личинок, которые отбирают из присланных

образцов сотов. Личинок растирают в фарфоровых ступках с 5 мл

физраствора, затем переносят в пробирки и нагревают на ки-

пящей водяной бане в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через

асбестовую вату (в воронках диаметром 4 см). Прозрачный

фильтрат разливают по

 мл в чистые уленгутовские про-

бирки и подслаивают такое же количество сыворотки: в первую

пробирку — преципитирующую плютоновую, во вторую — пре-

ципитирующую альвейную и т. д., в последнюю — нормальную

сыворотку лошади (для контроля). Сыворотки так же, как и эк-

стракты, должны быть прозрачными. Мутные сыворотки предва-

рительно фильтруют через асбестовую вату. РП проходит при

комнатной температуре. При положительной реакции на границе

сыворотки и антигена в течение

 мин появляется преципи-

тационное кольцо в виде тонкого серо-белого диска. Положитель-

ная РП с плютоновой, альвейной или другими специфическими

сыворотками свидетельствует о европейском гнильце. В кон-

трольной пробирке с нормальной сывороткой реакция должна

быть отрицательной. Реакцию капельной агглютинации ставят

с соответствующими сыворотками, аналогично американскому

гнильцу.

Лабораторные животные не восприимчивы к европейскому

гнильцу. Патогенные свойства возбудителей этого вида гнильца

могут быть установлены путем заражения

 личинок,

как и при американском гнильце.

ПАРАГНЙЛЕЦ. В лабораторию направляют кусочки сотов

с пораженным расплодом и куколками. Микроскопические и бак-

териологические исследования проводят по общепринятым мето-

дикам, описанным выше.

Вас.

 — палочка длиной

 мкм, шириной

 мкм (рис. 20). В погибших личинках и на питательных

средах она образует слегка овальные споры

 X

1,3 мкм. В бульонных культурах подвижна — перитрих, факуль-

тативный аэроб, плохо растет на обыкновенных питательных

средах (МПА и МПБ); хорошо культивируется на кровяном

сахарном агаре Цейслера и среде Томашеца (10

 сыворо-

точный мясо-пептонный агар, рН

 и мясо-пептонный

сывороточный бульон) при температуре

 °С. На повер-

хности среды образуются шероховатые колонии с синеватым

металлическим оттенком, обладающие ползучим ростом (рис.

21). Спорообразование на среде Томашеца и агаре Цейслера

плохое. Все штаммы Вас. paraalvei гидролизуют крахмал; обра-

зуют индол; восстанавливают нитриты; разжижают желатину; не

ферментируют глюкозу, рафинозу, маннит, салицин, адонит; ре-

акция Фогес — Проскауера отрицательная; тон гемолиза на кро-

вяном агаре не дает, что отличает его от Вас.

Патогенные свойства возбудителя могут быть установлены

путем заражения открытого расплода по методике, описанной

при американском гнильце.

73

_

 20. Bacillus paraalvei

 А.

 Смирнову).

Рис. 21. Колония Bacillus paraalvei. Увеличение

 А.

 Смирнову).

ПОРОШКОВИДНЫЙ РАСПЛОД. Для лабораторного ис-

следования в ветеринарную лабораторию посылают образцы

сотов от каждой семьи размером

 X 15 см с пораженными

личинками.

 палочка размером

 —

1,5 мкм в длину и

 мкм в ширину, споры

формы

 1,5 мкм), расположены центрально или терми-

нально; факультативный анаэроб.

Для выделения возбудителя в

 ячейки сота, содержащих

остатки разложившихся личинок, вносят по одной капле стериль-

ного физраствора. Бактериологической петлей переносят полу-

ченную взвесь на МПА в чашке Петри и равномерно распределя-

ют шпателем по его поверхности. Затем посевы инкубируют при

37

 Одновременно из взвеси готовят мазки, фиксируют пламе-

нем или раствором спирт-эфира (1:1), окрашивают по Граму

и исследуют под микроскопом. Через

 сут инкубирования

посевы просматривают. На МПА возбудитель растет в виде коло-

ний светло-оранжевого или светло-коричневого цвета, либо в ви-

де тонкого буроватого налета.

Из каждой чашки по две типичные колонии переносят на

скошенный мясо-пептонный агар для получения чистой культуры.

Для изучения морфологии выделенных чистых культур бак-

терий готовят мазки, фиксируют их, окрашивают по Граму

и микроскопируют. Подвижность культур определяют по характе-

ру роста в 0,3 %-ном полужидком МПА. Биохимические свойства

культур исследуют на средах с сахарами, желатине, казеине,

крахмало-аммиачном агаре, ставят пробу на каталазу. На средах

с глюкозой, маннитом, трегалозой они образуют кислоту, разжи-

жают желатину, разлагают казеин, не изменяют крахмал. Тест на

каталазу отрицательный.

Лучшее спорообразование происходит в течение

 дней

инкубации на МПА с добавлением экстракта пыльцы.

Положительный бактерио-

логический диагноз ставят при

выделении культуры Вас.

СЕПТИЦЕМИЯ. В лабора-

торию посылают не менее 10

штук больных пчел. При невоз-

можности доставить в лаборато-

рию живых пчел делают мазки-

отпечатки из грудных

Возбудитель —

 — полиморфная,

грамотрицательная, подвижная,

не образующая спор, палочка

длиной

 мкм, шириной

0,7—0,8 мкм (рис. 22); фа-

культативный аэроб, хорошо

Рис. 22. Pseudomonas apisepti-

cum. Увеличение

75

растет на обычных питательных средах (рН

 оптимум

роста 20—37 °С.

При микроскопическом исследовании поверхность хитиново-

го покрова груди пчел дезинфицируют обжиганием, прокалывают

перепонку между сегментами тонкой пастеровской пипеткой и на-

бирают гемолимфу, из которой затем готовят мазки и производят

посевы на питательные среды (МПА, МПБ). Мазки фиксируют

на пламени горелки и красят по Граму. В положительном случае

в мазках обнаруживают однородные грамотрицательные па-

лочки.

 apisepticum на агаре образует крупные, с ровными

краями мутно-опаловые в центре и светлые к периферии масляни-

стые, легко смывающиеся колонии. При сплошном росте на агаре

культура приобретает мутно-зеленоватый оттенок и гнилостный

запах; на пластинчатой желатине образуются колонии с глубо-

ким центром разжижения, при посеве уколом желатина воронко-

образно разжижается по ходу укола и выделяются пузырьки

 на агаре Эндо формируются красные колонии, цвет среды не

изменяется.

После получения чистой культуры изучают ее биохимические

свойства на наборе питательных сред (среды с углеводами, жела-

тина, молоко, МПБ с индикаторными бумажками для исследова-

ния на индол и сероводород, ломтик картофеля). Учет проводят

через

 сут. На картофеле вырастают хорошо заметные, вы-

пуклые, маслянистые колонии, постепенно темнеющие от бурого

до почти черного цвета; буреет и сам картофель.

 apisepticum свертывает и пептонизирует молоко;

образует кислоту, затем щелочь; выделяет сероводород; разлага-

ет без образования газа, но с накоплением щелочи фруктозу,

галактозу, маннозу, сорбит, глицерин, салицин; образует неболь-

шое количество кислоты в средах с рафинозой, арабинозой,

крахмалом, лактозой, изодульцитом; декстрин не разлагает, ни-

траты восстанавливает до нитритов; индола не образует.

ГАФНИОЗ. В лабораторию посылают живых больных или

мертвых пчел. В лаборатории выделяют чистую культуру возбу-

дителя болезни или ставят реакцию агглютинации.

В о з б у д и т е л ь —

 Это бактерия, имеющая

вид палочки с закругленными концами, длина ее

 мкм, шири-

на

 мкм; подвижная (перитрих), грамотрицательная,

хорошо красится всеми анилиновыми красителями. Факульта-

тивный аэроб. Спор не образует. При 20 °С она хорошо растет на

обычных и элективных питательных средах, ферментирует с обра-

зованием кислоты и газа глюкозу, с образованием кислоты —

арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, рамнозу; не дает реакции

с метилротом; образует ацетилметилкарбинол, сероводород; ути-

лизирует цитрат аммония; декарбоксилирует лизин и орнитин; не

гидролизирует аргинин; не ферментирует

 дульцит, ино-

зит, инулин, лактозу, рафинозу, салицин, сахарозу, сорбит и эрит-

рит; не дезаминирует фенилаланин; не разлагает дезоксирибо-

76

нуклеазу, мочевину, крахмал; не выделяет индол; не разжижает

желатину; не изменяет молоко.

Для получения культуры от каждой пробы берут по 10 пчел,

помещают их на 30 с в 96 %-ный спирт, затем обсушивают на

стерильной фильтровальной бумаге и вскрывают. Для этого

пчелу пинцетом фиксируют за грудку, стерильной препароваль-

ной иглой удаляют спинное полукольцо со стороны заднего

грудного тергита и из грудных мышц делают посев на среду Эндо.

Одновременно из мышц готовят два мазка на предметных стек-

лах, окрашивают один метиленовой синькой, второй по Граму

и просматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа.

Посевы выращивают при комнатной температуре

 °С). На

МПА бактерии гафнии растут в виде полупрозрачных, круглых,

с ровными краями колоний, легко снимающихся петлей. Из коло-

ний готовят мазки, красят по Граму, микроскопируют и сравнива-

ют с микрофлорой мазков из грудных мышц. Грамотрицательные

бактерии исследуют на подвижность. Подвижные грамотрица-

тельные бактерии пересевают на МПА, а затем делают посевы на

цветной ряд Гисса с глюкозой, лактозой, маннитом, сахарозой

и сорбитом; на среду с цитратом аммония; в две пробирки со

средой Кларка; в МПБ с индикаторными бумажками на индол

и сероводород и на желатину. Посевы бактерий на среде с цитра-

том аммония и в одной пробирке со средой Кларка выращивают

при комнатной температуре, остальные — при 35 °С. С культура-

ми, выращенными на среде Кларка при 35

 ставят реакцию

с метилротом, а при 20

 — реакцию Фогес — Проскауэр на

ацетилметилкарбинол. Желатину охлаждают.

Срок бактериологического исследования на гафниоз пчел

4 дня.

С е р о л о г и ч е с к а я  д и а г н о с т и к а гафниоза пчел

основана на постановке реакции агглютинации возбудителя со

специфической сывороткой.

Для постановки реакции агглютинации необходимы:

а) стандартная культура Hafnia alvei (стандартный анти-

ген);

б) гипериммунная сыворотка; ее получают от кроликов, для

этого животному вводят внутривенно выращенную на МПА

суточную культуру возбудителя в концентрации

 млрд. мик-

робных тел в 1 мл 4 раза через 5 дней в следующих количествах:

при первой инъекции — 0,5 мл, второй — 1 мл, третьей — 1 мл,

четвертой — 1,5 мл. Через

 дней после четвертой инъекции

у кролика берут кровь и получают сыворотку; ее можно использо-

вать в течение 10 мес при условии хранения в холодильнике при

температуре 4 °С;

в) нормальная сыворотка кролика;

г) физраствор, содержащий 0,85 % химически чистого на-

трия хлорида и 0,5 % карболовой кислоты;

д) исследуемый

 — смыв бактериальной культуры,

содержащий

 млрд. микробных тел в 1 мл. Для этого берут

77

20 пчел с признаками заболевания и помешают на

 мин в ста-

кан с углекислым газом. Затем берут гемолимфу тонким капилля-

ром, который вводят сбоку между 3 и 4 тергитами брюшка

и высевают на МПА. Посевы выращивают в течение суток при

35 °С.

Из гипериммунной сыворотки в физрастворе готовят после-

довательные разведения

 Затем в каждую

пробирку с указанными разведениями добавляют по две капли

исследуемого антигена.

Контролями реакции служат: нормальная сыворотка кроли-

ка в разведениях

 со стандартным антиге-

ном, физраствор со стандартным антигеном; физраствор с иссле-

дуемым антигеном; гипериммунная кроличья сыворотка в разве-

дении 1:100 со стандартным антигеном.

После разлива компонентов пробирки тщательно встряхива-

ют, помещают в термостат при 35 °С на 2 ч и проводят предвари-

тельный учет реакции. После этого пробирки оставляют при

комнатной температуре на

 ч и определяют окончательные

результаты реакций.

Реакцию учитывают в крестах:

+ + + + полная агглютинация, при которой осадок на дне

пробирки располагается кучкой или в форме от-

крытого перевернутого зонтика; надосадочная

жидкость совершенно прозрачная;

 почти полная агглютинация; осадок такой же, как

и в предыдущем случае; жидкость почти прозрач-

ная;

 слабая агглютинация; небольшой осадок, жид-

кость не прозрачная;

 отмечаются следы агглютинации, осадок едва за-

метен, жидкость не прозрачная;

— отрицательная реакция агглютинации. Бактерии

могут оседать на дно в виде точки, при встряхи-

вании разбиваются в равномерную муть.

Положительной реакцией считают наличие микроскопиче-

ской агглютинации с оценкой не менее чем в три креста в разведе-

ниях гипериммунной сыворотки 1:100 и выше и отсутствие

агглютинации в контролях.

САЛЬМОНЕЛЛ ЕЗ. Для лабораторного исследования посы-

лают живых больных пчел, а также соскобы фекалий с ульев или

сотов. При микроскопическом и бактериологическом исследова-

нии трупы пчел опускают в спирт, быстро обжигают для удаления

микрофлоры с поверхностных покровов, складывают в стериль-

ную ступку, добавляют физраствор, растирают и делают посевы

на МПА и МПБ. Для получения чистой культуры посевы произво-

дят из гемолимфы и грудных мышц. Гемолимфу получают путем

отделения одной из ножек или при помощи тонкой пастеровской

пипетки, которую вводят в боковую сторону брюшка.

Возбудители сальмонеллеза в организме пчел могут приобре-

78

сти изменчивость, которая выражается тем, что на плотных

средах формируются колонии, несвойственные для этих видов

бактерий (шероховатые с пальцеобразными выростами и др.).

Изменяются и биохимические свойства. Они теряют способность

ферментировать маннит, мальтозу или оба углевода одновре-

менно. В то же время бактерии могут приобрести новое свой-

ство — расщеплять сахарозу. Эта способность особенно выраже-

на у Sal. cholere suis. Изменчивость также касается и антигенно-

го строения микроорганизмов, что проявляется либо снижением

агглютинационного титра, либо полной потерей способности всту-

пать во взаимодействие с гомологичной для исходной культуры

антисывороткой.

Патогенные свойства возбудителей сальмонеллеза пчел изу-

чают на пчелах, которых помещают в специальный энтомологиче-

ский садок, в потолочное отверстие которого вставляют пробирку

вверх дном с бактериальной культурой, смешанной с густым

сахарным сиропом (1:3), предварительно обвязанную двумя

слоями марли. На 10 мл сиропа добавляют 0,1 мл

культуры, содержащей 1 млрд. микробных тел. В контрольном

опыте пчел кормят сахарным сиропом без микробной культуры.

В положительном случае через

 дня начинается массовая

гибель пчел, в то время как в контроле погибают только единич-

ные насекомые.

КОЛ И БАКТЕРИОЗ. В лабораторию посылают живых боль-

ных пчел. При бактериологическом диагнозе обязательно выделя-

ют чистую культуру возбудителя, изучают его культурально-

морфологические и биохимические свойства, определяют 0-анти-

ген, а при необходимости ставят биологическую пробу на пчелах.

От каждой пробы берут по 10 пчел и стерилизуют их по-

верхность ватным тампоном, смоченным спиртом. Затем с по-

мощью тонкооттянутой пастеровской пипетки берут гемолимфу,

переносят ее на поверхность подсушенного агара Эндо и растира-

ют шпателем, затем проводят посев в МПБ. Посевы выдержива-

ют сутки в термостате при температуре 32 °С. Одновременно от

тех же пчел готовят на предметных стеклах мазки, которые фик-

сируют раствором спирт-эфира (1:1) и окрашивают один мазок

фуксином или метиленовой синью, а другой — по Граму. Мазки

просматривают с использованием иммерсионной системы микро-

скопа через

 ч инкубирования. В тех случаях, когда на

среде Эндо роста нет, а в МПБ отмечается помутнение среды,

культуру микроскопируют и пересевают в чашку со средой Эндо;

через сутки проверяют наличие роста колоний. Э. коли на среде

Эндо образует округлые выпуклые колонии с ровным краем розо-

вого, красного или малинового цвета с металлическим блеском.

Для дальнейшего исследования переносят на скошенный МПА по

две произвольно взятых колонии или по две колонии каждой

разновидности в случае получения неоднородного роста (каждую

в 2 пробирки). Одну пробирку используют для изготовления

мазков, посева на дифференциально-диагностические среды и

79