Болезни и вредители пчел - часть 9

стерильной лошадиной сыворотки. Агар-агар используют только

растительный (нельзя брать для этой цели агар с рыбьим гидро-

лизатом, так как на нем Вас. larvae не растет).

2. Мясо-пептонный сывороточный бульон: к обычному (луч-

ше приготовленному из отвара конского мяса) мясо-пептонному

бульону (рН

 добавляют 10 % стерильной лошадиной

сыворотки.

3. Яичный агар и бульон Уайта: свежее яйцо протирают

ватным тампоном, смоченным этиловым спиртом, и обжигают на

огне, затем стерильно вскрывают; отделяют белок, желток выли-

вают в колбочку с 70 мл стерильной воды и тщательно смешива-

ют. К 5 мл расплавленного и охлажденного

 МПА,

или МПБ, в пробирке добавляют стерильно по 1 мл эмульсии

желтка и круговыми движениями пробирки между ладонями рук

тщательно смешивают агар или бульон с желтком. Перед посевом

среды выдерживают двое суток в термостате для определения

стерильности.

4. Кровяной агар Цейслера: 3 %-ный мясо-пептонный агар

(рН

 приготовленный из растительного агар-агара,

разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют в автоклаве 20 мин

при

 °С; по мере необходимости агар в колбе расплавляют

в водяной бане, а затем охлаждают до

 °С. К агару до-

бавляют 10 мл 20 %-ного стерильного раствора глюкозы и

20 мл стерильной свежевзятой или дефибринированной крови

овцы (лучше лошади). Смесь осторожно перемешивают (избе-

гать образования пены!) и разливают в стерильные чашки. Для

подсушивания среды чашки выдерживают в термостате

 ч.

Дефибринированную кровь можно заготавливать впрок (на

 дней), сохраняя ее в стерильных условиях по

 мл

в колбочках.

5. Кровяная среда Тошкова: к обычному или содержащему

желточную эмульсию мясо-пептонному агару или бульону до-

бавляют стерильно

 % дефибринированной крови лошади

6. Среда Майкла: дрожжевой экстракт — 10 см

3

, пептон —

10 г, растительный агар-агар — 15 г, тиамин — 0,1 мг, дистилли-

рованная вода — 1 л, рН — 6,8. Экстракт дрожжей готовят из

100 г измельченных хлебных дрожжей в 1 л водопроводной воды,

смесь тщательно перемешивают и кипятят 30 мин, затем отстаи-

вают, фильтруют в горячем состоянии через 3 слоя марли и остав-

ляют до просветления. Экстракт в этот же день употребляют для

приготовления среды или добавляют к нему 1 % хлороформа, что

позволяет сохранять его в холодильнике до месяца.

Получить чистую культуру Вас. larvae на плотной питатель-

ной среде из отдельных клеток возбудителя трудно. Поэтому на

поверхность плотной питательной среды необходимо вносить как

можно больше гнильцовой массы.

Видимый рост отдельных колоний Вас. larvae на среде

Томашеца появляется и заметен невооруженным глазом через
64

24 ч в виде типичных шероховатых (тип R) колоний размером

 мм в диаметре; они нежные, слегка выпуклые, вначале про-

зрачные, затем серо-белые. Колонии имеют характерные, отхо-

дящие в стороны, отростки в виде «усиков». При сплошном росте

на поверхности агара (через

 ч с момента посева) появля-

ются серовато-белые наложения, имеющие ограниченные локоно-

образные края. На мясо-пептонном сывороточном бульоне они

образуют через 24 ч помутнение. Через

 ч на дне пробирки

заметен хлопьевидный осадок в виде ваты, легко разбивающийся

при встряхивании в равномерную муть.

Наряду с типичными R-формами колоний встречаются и дис-

социированные от действия бактериофага и других факторов

атипичные RS-формы (переходные) с гладкими краями, с еди-

ничными нитевидными отростками или колонии S-формы круг-

лые, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью

13).

При просмотре мазков из атипичных колоний палочки Вас.

larvae бывают короткими и толстыми, они утрачивают способ-

ность располагаться цепочками, иногда встречаются уродливые

формы палочек — извитые, вздутые и др.

Б и о х и м и ч е с к и е  с в о й с т в а выделенных штаммов

Вас. larvae изучают путем выращивания на обычных питатель-

ных средах пестрого ряда, к которым добавляют 10 % стерильной

лошадиной сыворотки. Все типичные штаммы Вас. larvae медлен-

но

 дней) расщепляют глюкозу и левулезу с образованием

кислоты, но без газа, не сбраживают арабинозу, ксилозу, лакто-

зу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, галактозу, маннит, дульцит,

сорбит, инозит. Не образуют индола, аммиака, сероводорода

(отдельные штаммы слабо выделяют сероводород и аммиак).

Разжижают желатину, вызывают свертывание и пептонизацию

молока, не гидролизуют крахмал, нитраты восстанавливают, не

обладают гемолитическими свойствами, каталазный тест — отри-

цательный.

Рис. 13. Колонии Bacillus larvae:
/ —

 и 2— RS-форма. Увеличение X 56

 А.

 Смирнову).

3 О.

 Гробов и др. 65

С е р о л о г и ч е с к у ю  д и а г н о с т и к у проводят с по-

мощью реакции преципитации, используя ларвейную преципити-

рующую сыворотку или реакцию капельной агглютинации.

Антиген для реакции преципитации готовят из десяти по-

гибших от гнильца личинок, которых помещают в ступку, до-

бавляя десятикратное количество физраствора (15 мл для взрос-

лых и 7 мл для

 личинок), тщательно растирают,

суспензию нагревают на кипящей водяной бане 15 мин и фильтру-

ют через асбестовую вату до получения прозрачного экстракта.

Антигеном для реакции преципитации может служить и про-

зрачный фильтрат выросшей культуры, профильтрованной через

асбестовую вату. Фильтрат разливают

 мл в уленгутов-

ские пробирки и подслаивают такое же количество сыворотки

(сыворотки и фильтраты должны быть прозрачными). Реакция

преципитации протекает при комнатной температуре в течение

15 мин. При положительной реакции через

 мин образуется

тонкое, нежное, голубовато-матовое кольцо.

Антигены для реакции  а г г л ю т и н а ц и и готовят из

10 свежих трупов личинок или «корочек», которые помещают

в фарфоровую ступку и заливают

 мл карболизированного

0,5 %-ного физраствора, измельчают пестиком до получения

суспензии и фильтруют через ватный фильтр. Фильтрат центри-

фугируют

 мин при 1500 об/мин, затем осадок растворяют

в

 мл указанного выше физраствора, нагревают на водяной

бане до 70

 и в горячем виде фильтруют через бумажный

фильтр. Фильтрат вновь центрифугируют при тех же оборотах,

и из осадка готовят антиген в виде густой взвеси микробов и спор

(10 млрд/мл).

Реакцию агглютинации ставят на предметном стекле: на

один его конец пастеровской пипеткой наносят каплю агглютини-

рующей сыворотки, разведенной физраствором (0,1 мл сыво-

 мл физраствора), а на другой

 каплю физра-

створа. В обе капли вносят такое же количество антигена и хоро-

шо смешивают. При положительном результате в течение

 мин в капле с ларвейной сывороткой жидкость просветля-

ется и наблюдается мелкозернистая агглютинация (появляются

белые крупинки). В контрольной капле жидкость остается мут-

ной. Агглютинация в капле с ларвейной сывороткой свидетель-

ствует об американском гнильце.

Ф а г о д и а г н о с т и к у осуществляют с применением лар-

вейного бактериофага. На поверхность чашки Петри с мясо-

пептонным сывороточным агаром шпателем засевают две капли

суточной бульонной культуры и наносят в центр каплю бактерио-

фага. Чашку наклоняют для стока бактериофага, а затем перево-

рачивают ее кверху дном и ставят в термостат на

 ч. В по-

ложительном случае на месте протекания капли фага образуется

полоса, свободная от роста микробов.

Патогенные свойства устанавливают при заражении пчели-

ного расплода или кроликов. В стерильные бактериологические

66

чашки, на дне которых уложен слой ваты, покрытой двумя слоями

стерильной марли, вносят по 10 мл теплого корма: приготовленно-

го из перги — 50 г, пекарских дрожжей — 5 г, воды водопро-

водной — 100 мл. Смесь нагревают в водяной бане 45 мин при

температуре

 и после охлаждения добавляют равный объем

непрогретого меда. Затем в здоровой пчелиной семье от сота

с расплодом срезают острым, слегка подогретым ножом верхнюю

часть ячеек и осторожно извлекают

 личинок, кото-

рые размещают в бактериологических чашках по

 штук.

Через сутки выдерживания в термостате при температуре 35 °С

отбирают под контролем лупы здоровые (неповрежденные) ли-

чинки и переносят их в заранее подготовленную теплую чашку.

Личинок заражают путем скармливания им свежего корма,

к которому добавлено 2 млрд. исследуемых микроорганизмов.

Ежедневно под лупой отбирают больных личинок и подвергают

микроскопическому и бактериологическому исследованиям. Кон-

тролем служат незараженные личинки, содержащиеся в тех же

условиях.

Для заражения расплода в  м и к р о у л е й к а х и

 используют двухмиллиардную взвесь микробов в са-

харном сиропе (1 часть

 2 части сахара) ежедневно

в течение

 дней. Для получения инфицированного корма на

5 частей сиропа берут 1 часть культуры. Такой сироп дают 3—

5 дней. Суточное количество этой подкормки для пчел в

улье — 50 мл, для пчел в стандартном улье — 500 мл. Признаки

гнильца появляются через

 дней после заражения. С

5 дня до окончания биопробы пчелам в микроульях нужно давать

сахарный сироп. Подкормку наливают в банки, обвязывают их

двумя слоями марли и перевертывают вверх дном. В стандартных

ульях банки ставят на рамки, в микроульях — в потолочное

отверстие.

Для  п о с т а н о в к и

  н а  к р о л и к а х вна-

чале готовят споровую взвесь Вас. larvae из первичного материа-

ла. Для получения спор используют пчелиные личинки, погибшие

от американского гнильца и высохшие до состояния корочек.

Последние извлекают из ячеек сотов стерильным пинцетом, по-

мещают в стерильные фарфоровые ступки, растирают и добавля-

ют стерильный физраствор (1 мл на 1 растертую корочку).

Содержимое тщательно перемешивают. Полученную массу филь-

труют через вату. Если фильтрат вязкий, к нему добавляют

физраствор до исчезновения слизистой консистенции и снова

фильтруют через фильтровальную бумагу. После двукратного

центрифугирования фильтрата получают в осадке чистые споры

Вас. larvae, отмытые от тканей личинки. Концентрацию спор

в 1 мл определяют по оптическому стандарту мутности.

Заражают кроликов внутривенно споровой взвесью в дозе

 млн. спор в 1 мл (по оптическому стандарту мутности) на

одно животное, морских свинок подкожно дозой 3 млн. спор.

Гибель кроликов наступает на

 день,

 на

3 * 67

 14. Streptococcus

 (ланце-

товидные кокки). Увеличение

 А.

 Смирнову).

сут. Из крови больных и

внутренних органов павших

животных выделяют возбуди-

теля американского гнильца

пчел.

ЕВРОПЕЙСКИЙ ГНИ-

ЛЕЦ. Предварительное за-

ключение о результатах ис-

следования на европейский

гнилец может быть дано

в день поступления патмате-

риала на основании осмотра

сота и микроскопии мазков,

окончательный — после про-

ведения полного бактериоло-

гического исследования, т. е.

через

 дней при условии

выделения возбудителя бо-

лезни.

Для лабораторного исследования из ячеек сотов извлекают

стерильным пинцетом не менее 10 свежих трупов личинок, а при

их отсутствии — высохшие корочки трупов. Мазки и посевы

производят из содержимого кишечника личинки. Корочки трупов

предварительно помещают на

 мин в стерильный физра-

створ. Мазки окрашивают одновременно и по Граму, для окраски

спор возбудителя используют 2 %-ный спиртовой раствор карбо-

лового фуксина в течение

 мин.

При бактериологическом исследовании недавно погибших

личинок чаще обнаруживают Streptococcus pluton, в мазках,

приготовленных из загнившей массы личинок и их корочек, как

правило, находят споры Вас.

 иногда Вас. orpheus, а в маз-

ках из тела личинок с кислым запахом — Strept. apis.

Streptococcus pluton имеют форму вытянутых (ланцето-

видных) кокков размером

 мкм

 14). В мазках они

располагаются одиночно, чаще попарно, цепочками и в виде

характерных скоплений «розетками»; в культуре и тканях образу-

ют капсулу, окружающую несколько кокков, хорошо красящуюся

по методу Кленбергера, Томчика и Новелли. Микроб неподвижен,

спор не образует. Стрептококки красятся всеми анилиновыми

красками и по Граму (неравномерно), иногда с грамположитель-

ными встречаются и грамотрицательные кокки.

Из патматериала стрептококк плютон выделяют культивиро-

ванием посевов при 35 °С на средах Бейли или Черепова в анаэ-

робных условиях, для чего используют анаэростат или обычный

эксикатор, который после постановок чашек или пробирок с посе-

вами наполняют углекислотой

 %

 Последующее

культивирование выделенных штаммов этого возбудителя можно

производить и в аэробных условиях.

Для культивирования Strept. pluton используют:

68

 Среду Бейли: дистиллированная

 1 л, глюкоза,

растворимый крахмал и экстракт дрожжей — по

 г, калий

фосфорнокислый однозамещенный

 г, агар-агар

растительный — 20 г (рН 6,6). Среду автоклавируют при

в течение трех дней подряд по 20 мин. Первичный рост возбудите-

ля на этой среде появляется через

 сут, при последующих

пересевах — через

 ч.

2. Среду В. Т. Черепова: в 1 л водопроводной воды вносят

300 г очищенных клубней картофеля (обязательно удалить глаз-

ки!), варят в течение

 мин (не доводя до полного развари-

вания клубней), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и к 1 л

фильтрата добавляют  % растительного агар-агара, 3 г пептона.

Смесь стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин, затем добав-

ляют 3 % экстракта пекарских дрожжей и 3 % глюкозы,

рН 6,8.

Стерилизуют в аппарате Коха 3 дня по 30 мин или в авто-

клаве при 0,5 атм 3 дня по 15 мин.

3. Для культивирования Strept. pluton можно использовать

полужидкий 0,15 %-ный картофельный агар, приготовленный

аналогично среде Черепова, с той лишь разницей, что вместо 2 %

добавляют 0,15% растительного агар-агара.

На плотных средах Strept. pluton образует мелкие, круглые,

выпуклые, зернистые жемчужно-белого цвета непрозрачные ко-

лонии диаметром 1 — 1,6 мм (рис. 15). В печеночном бульоне

и полужидком агаре стрептококк растет с образованием помутне-

ния и нежного пристеночного кольца, на дне пробирки через двое

суток выпадает белый осадок. Strept. pluton расщепляет глюкозу

и фруктозу без образования газа, не расщепляет сахарозу, га-

лактозу, лактозу, малтозу, рафинозу, рамнозу, маннит, сорбит,

инозит, а-ксилозу, глицерин и крахмал.

Рис.

 Колония Streptococcus plu-

ton. Увеличение X 56

 А.

 Смир-

нову).

Рис. 16. Streptococcus apis. Уве-

личение X 900.

69

Strept. apis располагается в мазках короткими цепочками,

размер отдельных кокков

 мкм, грамположительная, спор

не образует, капсулы не имеет (рис. 16); факультативный аэроб,

хорошо растет при температуре 37 °С на обычных средах, а также

на средах Бейли, Черепова, кровяном агаре Цейслера. Через

24 ч на агаре образуются мелкие, прозрачные, бесцветные коло-

нии или наложения, они легко снимаются петлей и суспензиру-

ются в физрастворе. Микроб вызывает помутнение бульона,

разжижает МПЖ, молоко свертывает и пептонизирует, индол

и сероводород не образует, выделяет следы аммиака, углеводы

разлагает с образованием кислоты, крахмал не гидролизует,

нитриты не восстанавливает, на кровяном агаре не вызывает

гемолиза.

Вас.

 — спорообразующая палочка длиной 3—4,5, ши-

риной

 мкм (рис. 17); по Граму красится положительно,

подвижна, перитрих. Споры располагаются центрально,

4 мкм в длину и

 мкм в ширину, иногда образуют ряды

в виде частокола (рис. 16).

 факультативный

аэроб, растет при температуре 37 °С на обычном МПА и МПБ,

кровяном агаре Цейслера, через сутки образуя на агаре крупные

колонии неправильной формы в виде «оленьих рогов» грязно-

желтого цвета (рис. 18). На агаре Цейслера он образует гемолиз

типа р, иногда а. Бульон мутнеет равномерно, на

 день на его

поверхности образуется бесцветная или сероватая гладкая, не-

жная не стабильная пленка со слабым пристеночным кольцом.

При встряхивании она опадает хлопьями на дно пробирки. Вас.

alvei медленно разжижают МПЖ, молоко свертывают и пептони-

зируют, образуют индол; обнаруживаются следы аммиака и серо-

водорода; крахмал не гидролизируют, нитриты не

ют, расщепляют глюкозу, мальтозу, глицерин, лактозу, сахарозу

с образованием кислоты, но без газа. Биохимические свойства не

постоянны. Старые культуры имеют неприятный запах, особенно

сильный при культивировании микроба на кровяном агаре.

Вас. orpheus — спорообразующая подвижная с закруглен-

ными концами палочка длиной 2,5—5 мкм и шириной

 мкм.

Микроб окрашивается всеми анилиновыми красками и грамполо-

жительно. Споры хорошо окрашиваются 2

 спиртовым

раствором фуксина в течение 2 мин. В мазках вегетативные и спо-

ровые формы микроба располагаются поодиночке. Споры оваль-

ной формы длиной

 мкм и шириной

 мкм, распола-

гаются сбоку в средней раздутой части бациллы, характерно

также наличие с одной стороны споры арфо- или лодкообразного

параспорального тела (рис. 19). Бацилла орфеус-аэроб, растет

на обычных питательных средах (МПА и МПБ) и особенно хоро-

шо на печеночном агаре с нейтральной или слабощелочной

реакцией при температуре

 Для приготовления пече-

ночного агар-агара берут свежую печень крупного рогатого скота

или свиней, разрезают на куски массой

 г, заливают

равным количеством водопроводной воды и автоклавируют при

70

Рис. 17. Bacillus alvei:
/ — палочки; 2 — споры (типичное расположение в виде частокола) Увеличе-

ние

 А. М. Смирнову).

Рис. 18. Типичная форма колоний Bacillus alvei в виде «оленьих рогов».

Увеличение

 A.

 Смирнову).