РУКОВОДСТВО по оказанию фитосанитарных диагностических услуг (ФАО, Версия 1.1)

и запишите его в бумажном вари-
анте плана планшета. Напишите на
самом планшете, анализ какого ви-
руса проводится в какой колонке в
соответствии с планом планшета.

Смешайте антитела класса IgG,
специфичные для вируса, анализ
которого проводится, с покрыва-
ющим буфером в пластмассовом
блюдце весов. Добавьте 100

μл

в каждую лунку. Покройте по-
лимерной пленкой. Подпишите
подтверждающий документ и по-
ставьте дату, укажите компанию –
поставщика антисыворотки.

Инкубируйте при 37°C в течение
2-4 часов или всю ночь.

Подготовка образца:

Поместите образе в пакеты для
измельчения и разотрите. Добавь-
те 5 мл экстракционного буфера
(2% веса/объема PVP в ФСБРТ) до
растирания или сразу после него.
Этот объем можно откорректи-
ровать от 2 до 10 мл для семян от
маленького до большого размера.
Примечание: Для здоровых кон-
тролей используйте такого же хо-
зяина, как и образец, анализ кото-
рого проводится, если возможно.

Промойте планшет ELISA при по-
мощи ФСБРТ три раза вручную
или используя машину для мытья
планшетов. Высушите, промаки-
вая бумажным полотенцем, сло-
женным в несколько слоев.

В соответствии с планом планше-
та заполните планшет образцами,
здоровыми контролями и зара-
женными контролями. Добавьте
100 μл экстракта в каждую лунку.
Покройте липкой пластиковой
пленкой.

Инкубируйте в течение ночи в хо-
лодильнике при температуре 4°C.

Добавление ферментного конъюгата:

Промойте планшет ELISA при по-
мощи ФСБРТ один раз вручную,
чтобы удалить материал растений
или семян. Затем используйте ма-
шину для мытья планшетов или
помойте еще три раза вручную,
используя ФСБРТ. Позаботьтесь о
том, чтобы не осталось никакого
цветного остатка. Если необходи-
мо, помойте еще раз. Высушите,
промакивая.

Смешайте антитело, конъюгиро-
ванное со щелочной фосфатазой,
специфичное для вируса, анализ
которого проводится, с конъюгат-
ным буфером (0,2% веса/объема
БСА в ФСБРТ) в пластмассовом
блюдце для весов. Добавьте 100
μл в каждую лунку. Покройте лип-
кой пластиковой пленкой. При-
мите необходимые меры, чтобы
использовать конъюгированное
антитело, произведенное той
же компанией, которая указана
в разделе «Покрытие планшета»
подтверждающего документа.
Подпишите раздел «Конъюгат»
подтверждающего документа, как
только он будет добавлен.

Инкубируйте в течение 2–4 часов
при 37°C.

Добавление субстрата:

Помойте планшет ELISA в ФСБРТ
и высушите, промакивая, как и
раньше.

Приготовьте раствор: 0,1% в/о
4-нитрофенил фосфат динатрие-
вая соль гексагидрат (субстратный
порошок) в субстратном буфере,
в пластмассовой чашке для ве-
сов. Приготовьте 1 мл на каждую
колонку планшета (примечание:
10 мл достаточно для всего план-
шета). Добавьте 100 μл в каждую

лунку. Храните раствор в темном

месте, когда он не используется,

поскольку он светочувствитель-

ный. Подпишите подтверждаю-

щий документ и укажите точное

время, когда был добавлен суб-

стратный раствор.

Поставьте планшет в темное место

при комнатной температуре и пе-

риодически проверяйте, как про-

исходит окрашивание. Как прави-

ло, это займет максимум 1 час или,

вероятно, меньше в более теплом

климате (например, в лаборатори-

ях без кондиционеров в тропиче-

ских странах). Важно наблюдать

за пустым контролем, поскольку

он должен оставаться неокрашен-

ным, но со временем он обесц-

ветится. Для некоторых реакций

ELISA достигается оптимальная

инкубация, которая дифференци-

рует положительные анализы.

Анализ результатов: Существует целый

ряд сканеров для планшетов с соответ-

ствующим аналитическим программ-

ным обеспечением. Ниже представлен

пример одной из таких систем.

Прочтите показания абсорбции

в соответствии с инструкциями к

сканеру для планшетов.

Проверьте, чтобы зараженные

контроли превышали положи-

тельный порог и чтобы, в идеале,

показатель абсорбции был выше

0,5; если показания прибора –

слишком низкие, тогда оставьте на

большее время, чтобы они проя-

вились. Возьмите печатную копию

и приложите ее к плану планшета.

Если вы распечатываете документ,

то выделите на печатной копии

показания, которые превышают

положительный порог.

Выявление вирусов с использованием ПЦР

ПЦР описывается в разделе 5.1.5.2. До

того, как ПЦР можно будет использовать
для выявления вредного для растения
организма, необходимо выделить нукле-
иновую кислоту из исследуемого мате-
риала. Существует несколько методов

для выделения нуклеиновых кислот для
анализа. Выбор методов в любой лабо-
ратории зависит от основного источника
образца и от природы анализа, который
вы проводите. Вне зависимости от мето-
да процесс выделения будет включать в
себя три основных этапа: лизис, удале-
ние ингибиторов и отделение нуклеино-
вой кислоты.

Грубый лизис может включать в себя

такие физические методы как измельче-
ние, заморозка-оттаивание или химиче-
ские методы с использованием детерген-
тов, ферментов, хаотропных агентов или
простого кипячения клеток в буфере.
Методы экстракции нуклеиновых кислот
могут быть основаны на разной способ-
ности растворения нуклеиновых кислот
и белков в феноле и воде, как в методах
экстракции с использованием фенола/
хлороформа, или способности нуклеи-
новых кислот связываться с диоксидом
кремния, как в методах экстракции с ис-
пользованием диоксида кремния/ гуани-
дин изотиоцианата. Концентрирование
(отделение) выделенных нуклеиновых
кислот можно провести путем спирто-
вого осаждения или используя шарики
диоксида кремния.

Доступны коммерческие тест-

системы, содержащие все необходимые
химические реактивы, основанные на
использовании центрифужных колонок
или магнитных шариков. При отсутствии
тест-системы можно использовать сле-
дующий протокол, зачастую называе-
мый CTAB из-за использования броми-
стого цетилтриметиламмония (анг.

Cetyl

trimethylammonium bromide

– CTAB),

адаптированного из работы Чанга С.,
Пуриэра Дж. и Кэрни Дж. 1993 г. «Про-
стой и эффективный методы выделения
РНК из сосен». Журнал «Вестник моле-
кулярной биологии растений», 11: стр.
113–116 / Chang, S., Puryear, J. & Cairney,
J., 1993. A simple and efficient method
for isolating RNA from pine trees. Plant

5. Диагностика

Molecular Biology Reporter, 11: 113–116.
Его можно использовать для выделения
РНК из большинства типов раститель-
ного материала.

Протокол выделения РНК – лист растения

Для каждого образца проведите вы-

деление из растения или растений, ана-
лиз которых будет проводиться, а также
из известного здорового растения (если
возможно, того же вида) в качестве отри-
цательного контроля. Все этапы центри-
фугирования проводятся при 13000 g в
микроцентрифуге, если не указано иное.

Требуемое оборудование:

инструмент и пакеты для измельче-
ния;

пробирки для микроцентрифуги объ-
емом 2 мл (4 на каждый образец);

пипетки (P1000 и P200);

микродозаторы;

водяной термостат или другой инку-
батор, предварительно разогретый
до 65°C;

центрифуга (с соответствующим ро-
тором для раскручивания пробирок
для микроцентрифуги до 13000 g);

холодильник;

вытяжной шкаф;

реактивы:

CTAB-буфер для измельчения (не
менее 1 мл на образец);

хлороформ: изоамиловый спирт
(IAA) 24:1;

4 M хлористого лития (LiCl);

изопропиловый спирт;

70%-ный раствор этилового спир-
та в объемном отношении;

Буфер Tris-EDTA, содержащий 1%
SDS;

Стерильная вода без нуклеаз.

Процедура:

Поместите ткань, 100–200 мг, в пакет
для измельчения размером 10х15 см

(или аналогичный) и заморозьте в
жидком азоте перед тем, как измель-
чить ее в мелкий порошок, используя
маленький ручной валик.

Примеча-

ние:

Убедитесь, что вы не продыря-

вили пакет для измельчения, если это
произошло, заклейте его клейкой
лентой.

Измельчайте до тех пор, пока ткань
не начнет таять и не образуется «од-
нородная масса». Добавьте 1-2 мл
(т.е. 10 объемов) буфера для измель-
чения и тщательно перемешайте, ис-
пользуя валик.

Сцедите 0,7 мл сока растертого мате-
риала в пробирку для микроцентри-
фуги объемом 1,5 мл и инкубируйте
сок при 65°C в течение 10-15 мин.

После инкубации добавьте 700 μл
хлороформа: IAA (24:1) и перемеши-
вайте, опрокидывая пробирку вверх
дном, до образования эмульсии.

Центрифугируйте на максимальной
скорости в микроцентрифуге в тече-
ние 10 минут при комнатной темпе-
ратуре.

Необязательный этап – для исполь-
зования в случае с «трудной тканью»:
Осторожно снимите верхний (водя-
нистый слой) и перенесите его в но-
вую пробирку. Добавьте равный объ-
ем хлороформа: IAA, перемешайте и
прокручивайте, как и раньше.

Снимите водянистый слой с предель-
ной осторожностью, стараясь не за-
тронуть интерфазу. Добавьте равный
объем 4M LiCl, хорошо перемешай-
те и инкубируйте при 4°C в течение
ночи или 1 час при комнатной темпе-
ратуре.

Перемешайте в центрифуге в течение
20–30 минут на максимальной скоро-
сти при 4°C, чтобы осадить РНК.

Ресуспендируйте осадок в 200 μл
буфера TE, содержащего 1% SDS.
Добавьте 100 μл 5M NaCl и 300 μл
ледяного изопропилового спирта.
Хорошо перемешайте и инкубируй-

те при температуре –20°C в течение

20- 30 минут.

Центрифугируйте в течение 10 мин на

максимальной скорости при 4°C для

осаждения нуклеиновой кислоты.

Слейте надосадочную жидкость, со-

держащую соль и этиловый спирт.

Промойте осадок, добавив 500 μл

70%-ного этилового спирта и прокру-

тив в центрифуге в течение 3-4 минут

при 4°C.

Слейте этиловый спирт и высушите

осадок для удаления остаточного эти-

лового спирта. Примечание: Полно-

стью не высушивайте, поскольку оса-

док будет сложно ресуспендировать.

Ресуспендируйте осадок в 50 μл сте-

рильной воды без нуклеаз.

Процесс проведения ПЦР и контроли

В идеале, разные зоны лаборатории

(или разные лаборатории) будут предна-

значены для проведения разных этапов

процесса ПЦР с целью предотвращения

контаминации. Этапы, которые необхо-

димо разделить: (i) экстракция, (ii) поста-

новка ПЦР, (iii) введение ДНК и (iv) работа

после ПЦР.

Контроли контаминации должны

быть включены на каждом этапе про-

цесса. Таким образом, в каждую серию

экстракций должен быть включен здо-

ровый контроль (в идеале, того же или

близкородственного вида; пустой бу-

ферный контроль также можно исполь-

зовать). Анализ этого контроля будет

проводиться вместе с диагностически-

ми образцами, и этот контроль опреде-

лит любую контаминацию в процессе

выделения ДНК.

Контроли нескольких видов с водой

должны быть включены в процесс, как

описано ниже.

Пробирки закрываются после добав-

ления мастер-микса (предваритель-

но закрыты) – это указывает на то,

насколько чисты используемые реак-

тивы.

Пробирки оставляются открытыми в

процессе введения ДНК, но закрыва-

ются после (закрыты впоследствии)

– это указывает на любую перекрест-

ную контаминацию в процессе поста-

новки ПЦР (особенно при использо-

вании планшетов).

И наконец, пробирки, в которые до-

бавляется вода в конце процесса,

для указания перекрестной контами-

нации от образца к образцу или свя-

занной с пипеткой, использованной в

процессе постановки ПЦР.

Протокол традиционной ОТ-ПЦР

Реакции ПЦР должны ставиться на

льду или с исходными реактивами, раз-

мещенными на льду. Типичные условия

реакции – 25 или 50 μл; для использова-

ния в диагностике 25 μл более чем до-

статочно, чтобы провести повторный ге-

левый электрофорез, в то время как для

опытно-исследовательской работы и сек-

венирования более подходящим может

быть объем 50 μл. ПЦР с обратной транс-

крипцией (ОТ-ПЦР) может проводиться в

одно-пробирочном (с одной реакцией)

или двух-пробирочном (отдельный этап

ОТ) формате. В двух-пробирочном фор-

мате из реакции обратной транскрип-

ции в реакцию ПЦР добавляется кДНК,

тогда как в одно-пробирочном формате

этап ОТ проводится непосредственно

перед циклами ПЦР. Последний способ

предпочтителен для использования в

диагностике, поскольку он проще и по-

явление контаминации менее вероятно,

поскольку пробирка открывается толь-

ко после проведения ПЦР, оптимизация

одноэтапной ОТ-ПЦР обычно заключает-

ся в уменьшении количества обратной

транскриптазы M-MLV, включенной в ре-

акционную смесь.

Постановка ПЦР-реакций

Требуемое оборудование:

пипетки (P10 и P200);

микродозаторы;

96-луночные ПЦР-планшеты;

5. Диагностика

пленки или крышки для планшетов;

бокс для постановки ПЦР;

реактивы:

мастер-микс;

образцы.

Спланируйте, сколько реакций вам

понадобится, и какие лунки вы будете

использовать для каждого образца, ис-

пользуя план планшета. Рассчитайте объ-

емы, которые вам нужно будет добавить,

чтобы приготовить свой мастер-микс
для ОТ-ПЦР (см. табл. 1). Не забудьте, что,

в идеале, вам необходимо проводить два

параллельных анализа ваших образцов.

Отделите по 24 μл мастер-микса для

каждой лунки и затем добавьте 1 μл об-

разца или контроля в каждую из соот-

ветствующих лунок. Поместите планшет
в прибор для ПЦР и прогоните планшет
по программе ОТ-ПЦР.

5.4.4 Нематология

5.4.4.1 Введение в фитонематологию

Существует множество справочных

работ, в которых подробно описывает-
ся биология и патогенность как нематод
– паразитов растений, так и свободно-
живущих нематод. Введение в эту тему,
предложенное в работах Декрэмера и
Ханта / Decraemer and Hunt (2006 г.) и Хо-
кланда и др. / Hockland et al. (2006 г.), ча-
стично обобщено ниже.

Нематоды – первичнополостные,

несегментированные, червеподобные
животные, обычно описываемые как во-
лосовидные или нитевидные. Нематоды
– наиболее многочисленные многокле-
точные животные на земле. Они являют-
ся свободноживущими или паразитами
растений и животных. Хотя они встреча-
ются практически в каждой среде оби-
тания (Кобб / Cobb, 1915 г.), главным об-
разом, это водные животные. Нематодам
для передвижения и активной жизни
требуется влага. Поэтому почвенная вла-
га, относительная влажность и другие

факторы окружающей среды напрямую

влияют на выживание нематод. Однако

многие нематоды могут выживать в ан-

гидробиотическом состоянии.

Было подсчитано, что один акр

(0,405 га) почвы пахотной земли может

содержать без малого 3 000 000 000 не-

матод. Чтобы уменьшить воздействие

этого ограничивающего фактора, крайне

важно точно идентифицировать нема-

тод, вредных для растений, и понимать

их биологию. Многие фитопаразитиче-

ские нематоды наносят экономический

ущерб целому ряду сельскохозяйствен-

ных культур. Однако их присутствие не

всегда является очевидным для произво-

дителей, а симптомы часто приписывают

нарушению обмена веществ или другим

причинам. В прошлом сложность, свя-

занная с выявлением нематод, и недо-

статок информации об их биологии и

наносимом ими ущербе способствовали

увеличению риска того, что их незаме-

ченными неумышленно перемещали в

процессе торговли с их хозяевами или в

остатках почвы.

Многие нематоды, которые могут

иметь фитосанитарную значимость, вы-

являются фитосанитарными инспектора-

ми в пунктах ввоза в процессе междуна-

родной торговли. Часто это неизвестные

виды, которые могут потенциально стать

значимыми вредными организмами, если

позволить им проникнуть и акклиматизи-

роваться. Нематоды – вредные организ-

мы растений, которые ранее были неиз-

вестны или не очень хорошо известны,

могут стать объектом экстренных каран-

тинных действий с целью недопущения

их возможной интродукции и распро-

странения до того, как риски станут более

понятными. Меры должны модифици-

роваться с надлежащим учетом опыта и

получения новой информации. Кэннон и

другие / Cannon et al. (1999 г.) описывают,

как Соединенное Королевство утверди-
ло протокол для определения надлежа-
щих мер, и приводят примеры выявления

нематод – вредных для растений орга-
низмов в Соединенном Королевстве на
китайском пенджинге (карликовых дере-
вьях); другие примеры включают в себя
определенные виды галловых нематод
(

Meloidogyne

spp.), выявленных страна-

ми – членами Европейского союза на им-
портных черенках с корнями.

Нематоды проявляют целый ряд осо-

бенностей питания или трофизм. Некото-
рые виды нематод являются микрофага-
ми или микробиотрофами, питающимися
мелкими микроорганизмами, тогда как
другие – сапрофаги, питающиеся мерт-
вым или разлагающимся органическим
веществом. Многие виды нематод – фи-
тофаги, получающие питание напрямую
из растений, тогда как другие – всеядные
или хищники. Паразитирование на бес-
позвоночных или позвоночных также
распространено. Существует три основ-
ных типа паразитирования на растениях:
эктопаразитизм, эндопаразитизм и полу-
эндопаразитизм.

Эктопаразитизм:

Нематода остается

в почве и не проникает в ткани растений.
Она питается, используя свой стилет для
прокалывания клеток растения – чем
длиннее стилет, тем более глубокой ча-
стью ткани растения она может питаться.
Большинство видов эктопаразитических
нематод остаются подвижными, тогда
как другие, например,

Cacopaurus

, на-

всегда прикрепляются к корню с помо-
щью глубоко погруженного стилета.

Эндопаразитизм:

При этом типе

паразитизма вся нематода проникает в
ткань корня. Мигрирующие эндопарази-
ты, такие как

Pratylenchus

Radopholus

сохраняют свою способность к передви-
жению и не питаются в одном фиксиро-
ванном месте внутри ткани растения, при
этом более развитые малоподвижные
эндопаразиты питаются в одном фикси-
рованном месте и индуцируют работу
сложной трофической системы клеток-
«нянь» или синцитиев. Установление
специализированного участка питания

Таблица 1.

Пример расчета мастер-микса для одноэтапной ОТ-ПЦР

5. Диагностика

Реактив

Объем для одной реакции

Требуемый объем

Общее количество реакций

Стерильная вода без нуклеаз

34,75 μл

382,25

10х реакционный буфер

5 μл

25 мМ MgCl

3 μл

праймер 1 10μM

2 μл

праймер 2 10μM

2 μл

смесь dNTP (по 10 мМ)

1 μл

MMLV (раствор 1/50 в СДВ)

1 μл

Taq-полимераза (5 ед/μл)

0,25 μл

2,75

РНК

1 μл

увеличивает поток питательных веществ
от хозяина, тем самым позволяя самкам
становиться малоподвижными и туч-
ными по форме и высоко плодовитыми.
Малоподвижные эндопаразиты до уста-
новления участка питания также имеют
стадию развития, во время которой они
мигрируют. У галловых и цистообразую-
щих нематод только вторая ювенильная
стадия и взрослые самцы подвижны, но
у

Nacobbus,

например, все ювенильные

стадии, самцы и незрелые червеобраз-
ные самки – подвижны, и только взрос-
лая самка – малоподвижна.

Полу-эндопаразитизм:

Только пе-

редняя часть нематоды проникает в ко-
рень, а задняя часть остается в почве.

5.4.4.2 Требования к лаборатории

Лабораторные помещения, предна-

значенные для диагностики нематод –
вредных организмов растений требуют
наличия приемлемых условий изоля-
ции для работы с карантинными орга-
низмами. Подробное описание обору-
дования для выделения можно найти в
Стандарте ЕОКЗР (Европейская и Среди-
земноморская организация по каран-
тину и защите растений) по выделению
нематод (ЕОКЗР, 2013a).

5.4.4.3 Диагностика

Идентификация нематод лежит в ос-

нове всех аспектов исследований, кон-
сультативной работы, применения ка-
рантинного законодательства и выбора
стратегий борьбы. Классическая таксо-
номия в настоящее время дополняется
молекулярной диагностикой.

Стандартные протоколы по выделе-

нию видов регулируемых нематод пре-
доставлены МККЗР и каждой региональ-
ной организацией по карантину и защите
растений (РОКЗР). Протоколы по диагно-

стике всех видов нематод, карантинных
и регулируемых в Европейском регионе,
предоставлены ЕОКЗР (http://archives.
eppo.int/EPPOStandards/diagnostics.htm).
В этих документах приводятся типичные
симптомы питания и паразитирования
нематод, проявляющиеся на хозяине.

Выделение из субстрата

Существует много методов выде-

ления нематод из субстрата, включая
пассивные методы, методы препариро-
вания и флотационные методы. Черве-
образных нематод можно выделять из
тканей растений, семян, почвы и среды
выращивания, используя такие методы,
как вороночный метод Бермана (рис. 16),
модифицированный метод Бермана с ис-
пользованием ванночки (Хупер и Эванс /
Hooper and Evans, 1993 г.; рис. 17), адап-
тированный сахарно-флотационный ме-
тод (Кулен и Д’Эрде / Coolen and D’Herde,
1972 г.) или метод с использованием
орошения (Хупер и др. / Hooper et al.,
2005 г.). Также описаны разнообразные
методы для выделения цистообразцю-
щих нематод из субстрата, например, с
использованием прибора Фенвика (Фен-
вик / Fenwick, 1940 г.) или аппарата для
отмучивания почвы (Винфильд и др. /
Winfield et al., 1987 г.). Подробное описа-
ние процедур выделения можно найти в
Стандарте ЕОКЗР по выделению нематод
(ЕОКЗР, 2013a).

Растительный материал, который,

как предполагается, заражен фитопа-
разитическими нематодами, должен
обследоваться в кратчайшие сроки во
избежание его дальнейшей порчи и за-
ражения вторичными патогенами. По-
чва и среда выращивания до работы с
ними должны храниться при температу-
ре приблизительно 5°C в месте, куда не
попадают прямые солнечные лучи. Для
обеспечения хорошего качества выде-
ления рекомендуется осторожно обра-
щаться с почвой во избежание повреж-
дения нематод.

Рисунок 16.

Модифицированная воронка Бермана для выделения нематод из растительного материала или почвы

Вороночный метод Бермана – это

простой метод выделения активных не-
матод из почвы, семян и растительного
материала.

Он состоит из воронки с кусочком ре-

зиновой трубки, прикрепленной к нож-
ке воронки и перекрытой пружинным
кольцом или винтовым зажимом (реко-
мендуемый уклон воронки – около 30°).
Воронка помещается в держатель и поч-
ти полностью заполняется проточной
водой. Пластмассовое сито или прово-
лочная корзинка с ячейками достаточ-
но большого размера, чтобы нематоды
могли свободно проходить сквозь них,
помещается внутрь воронки. Почва или
растительный материал нарезается на
мелкие кусочки и помещается прямо на
сетку либо на однослойную ткань, раз-
мещенную на сетке; уровень воды затем
корректируется таким образом, чтобы
вода едва покрывала субстрат. Активные
нематоды проходят сквозь сетку и по-
гружаются на дно ножки воронки. Кро-
ме того, можно использовать воронки,

сделанные из пластмассы или нержаве-
ющей стали, или силиконовые трубки.
Однако, что касается последних, диффу-
зия кислорода в воду меньше, чем при
использовании полиэтиленовых трубок
(Столлер / Stoller, 1957 г.), что может мед-
ленно привести к асфиксии у нематод. В
зависимости от субстрата большинство
(50-80%) присутствующих подвижных
нематод будут выделены в течение 24-х
часов; однако образцы можно оставлять
в воронке до 72 часов, чтобы улучшить
показатели выделения. При длитель-
ном периоде выделения регулярное по-
стукивание и добавление свежей воды
увеличивает подвижность нематод и,
вследствие этого, показатель выделе-
ния. Эффективность выделения также
можно улучшить, добавив 1-3%-ный H

для снабжения кислородом (Тарджан /
Tarjan, 1967 г., 1972 г.). После периода вы-
деления небольшое количество воды,
содержащей нематоды, сливается и из-
учается под микроскопом (Флегг и Хупер
/ Flegg and Hooper, 1970 г.).

5. Диагностика

Метод опрыскивания Сейнхорста от-

личается от вороночного метода Берма-
на тем, что сок растения и токсичные про-
дукты распада смываются. В этом методе
воронку Бермана или чашку Остенбрин-
ка помещают в условия мелкокапельно-
го орошения или тумана во избежание
кислородного обеднения воды. Мелко-
капельное орошение осуществляется
при помощи распылителей, опрыскива-
ющих растительный материал под опре-
деленным давлением, или при помощи
распылителей, распрыскивающих воду
вверх таким образом, чтобы капли мягко
падали на растительный материал. Ак-
тивные нематоды покидают раститель-
ную ткань и смываются в воронку или
чашку, где они оседают. Нематод собира-
ют каждые 24–48 часов в стеклянный ла-
бораторный стакан посредством откры-
тия винтового зажима на ножке воронки
или сбора нематод на сито с размером
пор 20–25 μм. Выделение может длиться
до четырех недель. Этот метод описан
Хупером / Hooper (1986 г.).

Подвижные и неподвижные немато-

ды могут выделяться из растительного
материала методом Кулена и Д’Эрде /
Coolen and D’Herde (1972 г.). Раститель-
ный материал моется, нарезается на ку-
сочки размером около 0,5 см, и порции
по 5 г измельчаются в бытовом бленде-
ре с добавлением 50 мл водопроводной
воды при минимальной скорости пере-
мешивания в течение 2 минут. Суспензия
нематод и фрагментов ткани промывает-
ся через сито с размером ячеек 750 μм,
которое помещено над ситом с разме-
ром пор 45 μм. Остаток на сите с разме-
ром ячеек 45 μм собирается и заливается
в две центрифужные пробирки объемом
по 50 мл. Около 1 мл каолина добавляет-
ся в каждую пробирку, смесь тщательно
взбалтывается и затем центрифугирует-
ся со скоростью 3000 об/мин в течение
5 минут. Надосадочная жидкость слива-
ется, и в пробирки добавляется раствор
сахарозы (1,13 г/см

). Смесь тщательно

перемешивается и центрифугируется со
скоростью 1750 об/мин в течение 4 ми-
нут. Надосадочная жидкость смывается

Рисунок 17.

Модифицированный метод с использованием ванночки для выделения нематод

–

ванночка для проявки фотографий;

– проволочная корзина с пластмассовым покрытием;

– сетка с крупными отверстиями на пластмассовой под-

ставке;

– фильтр (однослойная ткань, молочный фильтр или хлопковая/нейлоновая ткань);

– тонкий слой почвы;

– достаточное количество воды,

чтобы намочить, но не затопить подвыборку.

через сито с размером ячеек 45 μм, оса-
док собирается, и нематоды изучаются
под стереомикроскопом. Вместо саха-
розы можно использовать ZnSO

, MgSO

или коллоидную двуокись кремния.

Предварительная идентификация

Определения терминов, используе-

мых в следующих разделах, можно найти
в публикациях ЕОКЗР (2013b).

Для различения фитопаразитических

нематод от других трофических групп
требуется, чтобы специалист прошел
полное обучение. Для обследования
морфологических характеристик и под-
готовки препаратов нематод с целью их
изучения требуется стереомикроскоп с
увеличением не менее 40-кратного. Три
основных типа ротового аппарата и пи-
щевода, а также соответствующих участ-
ков глотки, выделяемых у фитопаразити-
ческих нематод, показаны на рис. 18 и 19,
соответственно.

Приготовление препаратов нематод

Исследование морфологических при-

знаков должно проводиться у макси-
мально возможного количества взрослых
особей нематод. Существует множество
опубликованных методов фиксации и
приготовления препаратов нематод для
исследования, которые были совсем не-
давно обобщены в работе Манзанийа-
Лопеса и Марбан-Мендозы / Manzanilla-
López and Marbán-Mendoza (2012 г.).
Рекомендуется проводить осмотр нема-
тод, обработанных до состояния обезво-
живания и зафиксированных в глицери-
не, поскольку важные таксономические
характеристики могут быть нечеткими,
если образцы не достаточно очищены.

Временные препараты на предмет-

ных стеклах можно быстро приготовить
для незамедлительного осмотра, но та-
кие препараты могут использоваться
только в течение нескольких недель.

Если возможно, следует готовить по-

стоянные препараты для использова-
ния в будущем в качестве референтных
материалов и хранения в референтных
коллекциях нематод. Методы приготов-
ления постоянных препаратов нематод
были подробно описаны другими авто-
рами (Сейнхорст / Seinhorst, 1962 г.; Ху-
пер / Hooper, 1986 г.). Ниже описан метод
медленного выпаривания, описанный
Хупером / Hooper (1986 г.).

Временные препараты

Маленькая капля воды помещается

на стеклянное предметное стекло с лун-
кой в количестве, достаточном, чтобы
заполнить лунку. Нематоды переносят-
ся в воду и нагреваются до 65°C. Важно,
чтобы нагрев был достаточным только
для того, чтобы нематоды погибли, по-
скольку длительный нагрев приведет к
повреждению и разрушению образцов.
На практике 10-15 секунд над горячей
плиткой будет достаточным периодом
времени для большинства видов, но
рекомендуется проверять предметное
стекло через определенные промежутки
времени, чтобы следить за процессом и
прекратить нагрев, только когда прекра-
тится движение всех нематод.

Берется предметное стекло, свобод-

ное от пыли, и кладется на край столика
микроскопа. Маленькая капля фиксато-
ра ТАФ одинарной концентрации (7 мл
формалина (40%-ный формальдегид), 2
мл триэтаноламина, 91 мл дистиллиро-
ванной воды) или другого подходящего
фиксатора наносится в центр предмет-
ного стекла, вокруг капли помещается
надлежащее количество стружки пара-
финового воска (воск поможет поддер-
жать покровное стекло и зафиксировать
его на предметном стекле).

Нематод переносят с предметного

стекла с лункой в фиксатор ТАФ, так что-
бы они были размещены под выпуклой
областью в центре капли и не пере-

5. Диагностика

Рисунок 18.

Область ротовой полости и типы ротового аппарата у фитопаразитических нематод

– Одонтостилетные (со стилетом в стенке пищевода, заканчивающимся дорсально скошенным отверстием) и одонтофорные (с мускулистым валиком в

ротовой полости, который поддерживает радулу) (

Longidoridae

– Стоматостилетные - со стилетом в ротовой полости с кутикулярным придатком (сме-

щенным внутрь) у основания головы (

Tylenchomorpha

– Онхиостилетные (с копьем) (

Trichodoridae

передний отдел стомы;

стилет в стенке пищево-

да;

соматические мышцы;

мышцы, вытягивающие стилет;

мускулистый валик с гребнями;

перстома;

утолщение кутикулы вокруг престомы;

отверстие стилета;

стома;

10.

конус стилета;

11.

копье и выступы стилета;

12.

основание головы;

13.

детальное изображение кутикулы, демонстри-

рующее исчезновение срединной и бороздчатой зоны в районе головы;

15.

копье с твердым «зубом»

(14)

и расширение «зуба»

(15)

;

16.

ротовые

мышцы. Рисунок взят из работы Декрэмера и Ханта / Decraemer and Hunt (2006 г.) с разрешения авторов.

крывали друг друга. Количество экзем-
пляров, которые могут поместиться на
предметном стекле, зависит от размера
нематод.

Покровное стекло соответствующего

размера осторожно протирается тканью
для чистки оптики. Его осторожно опуска-
ют на восковые стружки, так чтобы оно
соприкоснулось с ТАФ. Предметное стек-
ло помещают на плитку и наблюдают за
ним до тех пор, пока воск не растает, воз-
дух, который мог остаться под покровным
стеклом, удаляют, мягко постукивая по
предметному стеклу. Затем предметное
стекло снимают с плитки и изучают.

В центре должен быть прозрачный

участок с фиксатором ТАФ, содержащим
нематоды, и сплошное кольцо из воска
для того, чтобы запечатать предметное
стекло.

Если восковая прокладка нарушится

или нематоды погрузятся в воск, пред-
метное стекло опять разогревают, по-
кровное стекло осторожно снимают,
нематод достают и фиксируют на новом
предметном стекле. Если воск растекся
из-под покровного стекла, его убирают
тонким лезвием.

Покровное стекло запечатывается

при помощи лака для ногтей, полоска
которого наносится по окружности.
Когда лак высохнет, образцы готовы для
изучения.

Постоянные препараты

Маленькую каплю воды помещают

на предметное стекло с лункой в коли-
честве, достаточном для заполнения
лунки. Нематод переносят в воду и на-
гревают до 65°C. Крайне важно, чтобы
нагрев был достаточным для того, что-

100

Рисунок 19.

Пищеварительная система таксонов фитопаразитических нематод

– род Paraxiphidorus (Longidoridae).

– род Paratrichodorus (Trichodoridae).

– род Pratylenchoides (Pratylenchidae).

– род Aphelenchoides (Aphelenchoididae).

передний отдел стомы;

фарингостома;

узкая передняя область глотки;

глоточная выпуклость;

соединение глотки и кишки;

перешеек (ист-

мус);

стилет в ротовой полости;

прокорпус;

метакорпус;

10.

пост-корпус;

11.

ядра вентросублатеральных глоточных желез;

12.

дорсальное ядро

глоточной железы;

13.

кишка;

14.

кишка, дорсально перекрывающая глотку;

15.

клетка клапана соединения глотки и кишки;

16.

доля глоточной железы;

17.

дорсальное отверстие глоточной железы. Рисунок взят из работы Декрэмера и Ханта / Decraemer and Hunt (2006 г.) с разрешения авторов.

бы нематоды погибли, поскольку дли-
тельный нагрев приведет к деформации
и разрушению образцов. На практике
10-15 секунд над горячей плиткой будет
достаточным периодом времени для
большинства видов, но рекомендует-
ся проверять предметное стекло через
определенные промежутки времени,
чтобы следить за процессом и прекра-
тить нагрев, только когда прекратится
движение всех нематод.

Нематод переносят в чашку для куль-

тивирования эмбрионов или на подхо-
дящее часовое стекло, наполовину за-
полненные фиксатором ТАФ одинарной
концентрации (7 мл формалина (40-%-
ный формальдегид), 2 мл триэтанолами-
на, 91 мл дистиллированной воды). Она
закрывается и оставляется, как минимум,
на одну неделю.

Образцы переносятся на часовое

стекло с раствором 3%-ного глицерина

с остаточным содержанием ТАФ. Нема-

тоды должны быть погружены в раствор.

На часовое стекло следует положить по-

кровное стекло и оставить его на ночь.

Покровное стекло слегка смещается,

чтобы появилась небольшая щель для

обеспечения испарения, и предметное

стекло оставляют в инкубаторе (при тем-

пературе приблизительно 40°C) до тех

пор, пока не испарится вся вода (это мо-

жет занять не менее недели). Одновре-

менно небольшой лабораторный стакан

с глицерином помещают в инкубатор для

того, чтобы из него испарилась вся вода.

С использованием шприца или пи-

петки небольшую каплю глицерина по-

мещают в центр предметного стекла,

куда переносят и нематод, размещая их

в центре.

Тщательно подбирается три опоры

для покровного стекла, такие как сте-
клянные шарики одинакового с нема-

5. Диагностика

101

тодами диаметра, которые помещают
вдоль края капли глицерина на расстоя-
нии друг от друга таким образом, чтобы
они образовали равномерную опору.

Небольшое количество стружки па-

рафинового воска помещают через рав-
номерные отрезки по контуру вокруг
капли глицерина.

Покровное стекло нагревают на на-

гревательном блоке в течение несколь-
ких секунд. Покровное стекло про-
тирается тканью для чистки оптики и
осторожно опускается на воск, чтобы со-
прикоснулись только покровное стекло
и глицерин.

Предметное стекло помещают на на-

гревательный блок и, как только воск
растает, и все пузырьки воздуха будут
вытиснуты помещенным сверху покров-
ным стеклом, предметное стекло снима-
ют с нагревательного блока и дают воску
перераспределиться.

Когда воск полностью затвердеет,

весь его избыток удаляют скальпелем по
периметру покровного стекла.

Покровное стекло запечатывают при

помощи герметизирующей пасты, такой
как «Glyceel», или прозрачным лаком
для ногтей, полоска которых наносит-
ся по окружности. Предметное стекло
маркируется при помощи нестираемого
маркера или этикетки для предметных
стекол, которая приклеивается к нему.
Указывается классификация, дата приго-
товления препарата, хозяин, местность,
номер образца (если применимо) и ис-
пользованный метод сохранения.

Идентификация до видового уровня

Классификацию популяции нематод

проводить сложно, для этого требуется
понимание морфологии, филогении и
таксономии нематод. Если предполага-
ется, что выявлен организм, внесенный в

перечень карантинных, или новый орга-

низм, подтверждение его видовой при-

надлежности должно осуществляться

специалистом.

Для идентификации с использовани-

ем светового микроскопа рекомендует-

ся увеличение от 400- до 1000-кратного

(масляно-иммерсионная линза) и диф-

ференциально-фазовый контраст (ДИК).

Стандартные протоколы по морфоло-

гической идентификации и молекуляр-

ному подтверждению предоставлены

МККЗР и каждой из РОКЗР.

5.4.5 Энтомология

Введение в идентификацию насеко-

мых дается Королевским энтомологиче-

ским обществом: http://www.royensoc.

co.uk/insect_info/introduction.htm

Работа должна проводиться в без-

опасной лаборатории, располагающей

условиями изоляции, обеспечивающими

невозможность попадания вредных ор-

ганизмов в окружающую среду. Требует-

ся следующее основное оборудование:

Основное оборудование:

препаровальный бинокуляр (до

160-кратного увеличения) для обще-

го осмотра образцов при малом уве-

личении и для скрининга образцов;

источник холодного света с оптико-

волоконными световодами;

биологический микроскоп (до

1000-кратного увеличения, со встро-

енным источником света) для изуче-

ния образцов, зафиксированных на

предметных стеклах;

нагревательный блок или кипятиль-

ная плитка (нагрев до 120°C)

печка для подготовки предметных

стекол;

лабораторный инкубатор для разве-

дения образцов;

бытовой холодильник для хранения

образцов;

бытовая морозильная камера для

утилизации образцов.

102

Вспомогательное оборудование:

белые эмалированные лотки для об-
разцов;

одноразовые пластмассовые чашки
Петри разных размеров;

чашки для культивирования эмбрио-
нов и часовые стекла;

предметные стекла для микроскопа
(стандартные и с лунками);

покровные стекла (13 мм и 18 мм);

стальная линейка (20 см, деления по
1/10 мм);

энтомологические булавки;

оборудование для препарирования,
включая: «поисковые иглы», скальпе-
ли и лезвия, пинцеты (разные, вклю-
чая энтомологические пинцеты), тон-
кие кисти, мелкие булавки или что-то
подобное и пастеровские пипетки;

спиртовая горелка.

Основные реактивы:

деминерализованная вода;

этиловый спирт (разведенный с очи-
щенной водой до 60- и 70%-ных рас-
творов);

метиловый спирт;

10%-ный раствор гидроксида калия
(KOH);

растворитель уайт-спирит (раствори-
тель для лаков);

безводная уксусная кислота;

гвоздичное масло;

среда Хайнца для фиксации на пред-
метных стеклах;

канадский бальзам и растворитель;

краситель ткани с фуксинсернистой
кислотой.

Прочее оборудование:

сменные лампочки и предохранители
для микроскопа;

иммерсионное масло для микроскопа;

ткань для чистки оптики;

аэрозольный баллон со сжатым воз-
духом;

механизм для смены лезвий скальпеля;

контейнер для утилизации острых

предметов;

бутылки и стеллажи для реактивов;

бутылка для отработанных реакти-

вов;

термостойкие пробирки из стекла

пирекс, держатель и штатив для про-

бирок;

пробковая плитка;

лабораторная бумага (рулон);

одноразовые перчатки;

нестираемые фломастеры (толстые и

тонкие);

прозрачные пластиковые мерные

пробирки с завинчивающимися

крышками;

пробирки типа Эппендорф (0,5 мл и

1,0 мл);

коробки для разведения насекомых;

прозрачные полиэтиленовые пакеты;

пакеты для автоклава.

5.4.5.1 Диагностика

Традиционная идентификация насе-

комых, в основном, основана на иссле-

довании под микроскопом морфологи-

ческих свойств, что может потребовать

особой подготовки образцов для иссле-

дования, применения ключей (обычно

дихотомных) и сравнения с одним или,

желательно, целым рядом подтверж-

денных образцов. Этот подход остается

наиболее малозатратным и доступным

средством проведения диагностики на-

секомых. Большинство ключей, но не

все, основаны на характеристиках взрос-

лой стадии развития, но в фитосанитар-

ной диагностике чаще всего встречаются

особи именно на незрелых стадиях раз-

вития, перемещаемые в процессе тор-

говли (т.е. яйца, личинки или куколки); в

таких случаях зачастую необходимо их

вырастить до идентифицируемой ста-

дии. Кроме того, другие сведения также

могут помочь идентификации или уско-

рить ее, например, связь с хозяином, гео-

графическое происхождение и данные о
распространении вредного организма.

5. Диагностика

103

На сегодняшний день описано око-

ло миллиона видов насекомых, что со-
ставляет 80-90% от всех известных форм
жизни животных, но все еще существует
гораздо больше видов, которые должны
быть официально описаны, и, по оцен-
кам, в конечном итоге это может соста-
вить от 6 до 10 млн. видов. Известные
существующие виды насекомых на се-
годняшний день систематики разделили
на порядка 23 разных отряда. При таком
огромном количестве таксонов в рамках
способностей или опыта одного челове-
ка невозможно оказать всеобъемлющие
диагностические услуги. Большинство
видов вредителей растений на самом
деле, однако, принадлежат только пяти из
этих отрядов, а именно:

Coleoptera

(жуки),

Diptera

(мухи),

Hemiptera

(полужесткокры-

лые),

Lepidoptera

(мотыльки и бабочки)

Thysanoptera

(трипсы). Хороший фито-

санитарный энтомолог общей практики
должен уметь свободно распознавать
эти отряды и ключевые виды вредителей,
принадлежащие к ним, но сверх того для
диагностики могут потребоваться навыки
специалиста по идентификации.

Один опробованный и испытанный

метод оказания услуг по энтомологи-
ческой диагностике функционирует
на основе системы «сортировки», при
которой энтомологи общей практики
определяют приоритетность вновь при-
бывших образцов, проводя идентифи-
кацию большинства повседневных об-
разцов. Это включает в себя просмотр
образцов, таких как растительный ма-
териал или клейкие ловушки на выявле-
ние беспозвоночных, представляющих
интерес, и при необходимости подго-
товку беспозвоночных для самостоя-
тельного изучения или изучения стар-
шими специалистами по диагностике
(например, очистка образцов и после-
дующая их фиксация на предметных сте-
клах для микроскопа). Когда они в про-
цессе диагностики дошли до того этапа,
до которого смогли, в случае необхо-

димости приглашается более старший
или узкий специалист по диагностике.
Как только диагностика завершена, до-
кумент с ее результатами должен под-
писать только назначенный энтомолог.
Например, в соответствии с ИСО 17025
только те энтомологи, которые прошли
официальное обучение и тестирование
по идентификации (что четко указано
в их документах о прохождении обуче-
ния), могут ставить свою подпись под
результатами идентификации.

Как для энтомологов общей прак-

тики, так и для специалистов знания и
опыт – чрезвычайно важны, чтобы они
могли оказывать услугу по диагностике
эффективно и точно. Виды могут незна-
чительно отличаться, и подтверждение
диагностики может быть достоверно
осуществлено только опытным специ-
алистом по диагностике. Такие навыки
могут развиться только со временем
посредством обучения, работы с на-
ставником и сотрудничества и коллек-
тивной работы с другими экспертами и
специалистами.

5.5 Дополнительная информация

Интернет обеспечивает доступ к

огромному количеству информации для
использования в качестве основы про-
ведения диагностики и развития зна-
ний и экспертного опыта. В этом разде-
ле приводится информация о ключевых
справочных материалах по вредным
для растений организмам, а также ука-
зываются центры передового опыта и
экспертные базы данных.

5.5.1 Руководства и сайты

К ключевым источникам инфор-

мации относятся: Американское фито-
патологическое общество (АФО), база
данных Международного центра
сельскохозяйственных исследований
«CAB abstracts», ЕОКЗР, а также более
общие поисковые интернет-системы
(например, Google). Особенно полезны

104

последние публикации или книги,
описывающие вредные организмы
определенных сельскохозяйственных
культур, и их относительно легко можно
найти, используя интернет-поиск по
ключевым словам (например, вирусы,
маниока).

Полезно начать со Справочника

Международного центра сельскохозяй-
ственных исследований (CABI) по защите
сельскохозяйственных культур и Спра-
вочника CABI по лесоводству. При поис-
ке информации в этих справочниках по
названию хозяина вы получите общий
список вредных организмов, связанных
с этим хозяином, который затем можно
доработать, осуществив поиск в систе-
ме ЕОКЗР «PQR» (база данных по каран-
тинным вредным организмам). Полезно
включить все известные симптомы, вы-
зываемые вредным организмом, даже
если они не использовались в течение
некоторого периода времени.

В некоторых случаях может возник-

нуть необходимость в рассмотрении
всех организмов, связанных с опреде-
ленным хозяином, и поэтому следует
принять во внимание, является ли этот
вредный организм – истинным вредным
организмом, вторичным патогеном или
просто случайным обнаружением.

Названия организмов меняются по

мере появления большего количества
таксономической информации, и по-
этому важно проверять названия ор-
ганизмов, утвержденные в последнее
время, а также все симптомы и устарев-
шие названия.

Одним из полезных общих ресур-

сов является сайт Каталога жизни
(http://catalogueoflife.org) и (http://www.
species2000.org/), где представлены не-
давно принятые названия целого ряда
организмов. Утвержденные названия

грибов и их синонимы доступны на
сайте «Index fungorum» (http://www.
indexfungorum.org), тогда как утверж-
денные названия бактерий и фитоплазм
доступны на сайте МОФП (http://www.
isppweb.org) и в работе Фиррао и др. /
Firrao et al. (2004 г.): http://taxonomicon.
taxonomy.nl/TaxonTree.aspx?id=1007020,
соответственно.

Ниже приведены ключевые ресурсы

по каждой группе вредных организмов.

5.5.1.1 Патогены – общая информация

Заметки в журнале «Болезни расте-

ний» / Plant Disease» http://www.apsnet.
org/publications/plantdisease/Pages/
default.aspx

Банк знаний «Plantwise»: http://www.

plantwise.org/KnowledgeBank/home.aspx

Международное общество инфекци-

онных болезней, Программа мониторин-
га новых болезней (ProMED), О ProMED-
корреспонденции. Доступно по ссылке:
http://www.promedmail.org (последний
доступ осуществлен 16 сентября 2015 г.).

БОПР, Сообщения о новых болезнях:

http://www.ndrs.org.uk/

Справочник CABI по защите сель-

скохозяйственных культур. Доступен
по ссылке: http://www.cabi.org/cpc/ (по-
следний доступ осуществлен 16 сентя-
бря 2015 г.).

Молекулярная фитопатология:

http://onlinelibrary.wiley.com/journal/

10.1111/%28ISSN%291364-3703

ЕОКЗР (Европейская и Средизем-

номорская организация по каранти-
ну и защите растений), Деятельность
ЕОКЗР в сфере карантина растений. До-
ступно по ссылке: http://www.eppo.int/
QUARANTINE/quarantine.htm (последний
доступ осуществлен 16 сентября 2015 г.).

5. Диагностика

РУКОВОДСТВО по оказанию фитосанитарных диагностических услуг (ФАО, Версия 1.1) - часть 7