РУКОВОДСТВО по оказанию фитосанитарных диагностических услуг (ФАО, Версия 1.1)

существует ли потребность в высокой
специфичности. Иммунологические ана-
лизы могут визуализировать связь «ан-
титело-антиген» напрямую либо опосре-
дованно.

Выявление количества антител или

антигенов можно проводить разно-
образными методами. Одним из наи-
более общепринятых является метод
маркировки антигена либо антитела.
Маркировка может состоять из фермен-
та, коллоидного золота (иммунохрома-
тографические анализы), радиоизотопа,
магнитного мечения или флуоресцен-
ции. К другим способам относятся: аг-
глютинация, нефелометрия, турбидиме-
трия и вестерн-блоттинг.

Что касается иммунологических ана-

лизов, проводимых в лабораториях,
большинство этих методов заменил ме-
тод ELISA (фермент-связанное иммуно-
сорбентное исследование). В анализе
ELISA неизвестное количество антиге-
на закрепляется на поверхности, такой
как 96-луночный микропланшет. Затем
следует этап блокировки, чтобы предот-
вратить связывание с неспецифическим
антителом. Затем специфическое анти-
тело прикрепляется к поверхности для
связывания с антигеном. Антитело свя-
зано с ферментом и на последнем этапе
добавляется субстрат, который фермент
может преобразовать в какой-нибудь
обнаруживаемый сигнал. Например,
при проведении флуоресцентного ана-
лиза ELISA, когда образец подвергается
воздействию света соответствующей
длины волны, любой комплекс «антиген
– антитело» будет флуоресцировать. Ин-
тенсивность флуоресценции можно ис-
пользовать для определения количества
антигена, присутствующего в образце.
ELISA остается одним из методов, наи-
более широко используемых для выяв-
ления вирусов растений в повседневной
практике, хотя методы амплификации
нуклеиновых кислот в настоящее время

в повседневной практике используются
чаще. Анализы ELISA – высокочувстви-
тельны, легко воспроизводимы, с их по-
мощью можно установить количество
патогена, и их проведение может быть
автоматизировано. ELISA – это устойчи-
вый анализ, который можно проводить
почти в любой лаборатории, и для этого
требуется минимальное обучение.

Несмотря на то, что у метода ELISA

много преимуществ, к его недостаткам
относится тот факт, что при помощи это-
го анализа можно выявить не все штам-
мы патогена, и что для многих организ-
мов диагностические наборы ELISA еще
не разработаны. Производство антител
также может быть ресурсоемким, напри-
мер, требующим использования живых
животных, в отличие от методов ПЦР, для
которых доступно огромное количество
данных по последовательностям, и про-
ведение анализов можно организовы-
вать, используя персональный компью-
тер с доступом в интернет. Метод ELISA
также менее чувствителен, чем ПЦР.

5.1.5 Методы выявления, основанные на

выделении нуклеиновых кислот

Наука о выявлении вредных для рас-

тений организмов на основании нуклеи-
новых кислот получила стремительное
развитие за последние 20–30 лет, и в ли-
тературе описывается много разных ме-
тодов.

Говоря простыми словами, подавля-

ющее большинство этих методов осно-
вано на знании о последовательности
нуклеиновых кислот организма и за-
ключении о таксономической специфич-
ности (например, семейство, род, вид,
штамм). На выбор метода большое вли-
яние оказывает требуемый результат,
особенно уровень требуемой специфич-
ности и объем материала для анализа.

Последовательность нуклеино-

вых кислот любого организма состо-
ит из участков, ставших стабильными

на разных этапах эволюции: высоко-,

умеренно- и низко-консервативных по-

следовательностей. Как правило, гены,
кодирующие важнейшие процессы (та-

кие как гены рРНК), – высоко консер-

вативны, тогда как менее важные гены

могут быть умеренно-консервативными

и низко-консервативными с некодирую-
щими участками. Эти различия в после-

довательностях не только обеспечили

подтверждающими доказательствами

существующую таксономическую клас-

сификацию организмов, но и привели к

ее пересмотру. Эти же последователь-

ности также формируют базу знаний для
разработки коротких последовательно-

стей нуклеиновых кислот, специфичных

для таксонов (рода, вида и т.д.), которые

можно использовать в качестве зондов в
гибридизации или в качестве праймеров
в методах, основанных на ПЦР (как опи-
сано ниже). Сегодня мы находимся на по-
роге революции в сфере полногеномно-
го секвенирования, и объем данных по
последовательностям, содержащимся в
базах данных, таких как «GenBank», по-
стоянно увеличивается, позволяя раз-
рабатывать высокоинтеллектуальные
методы диагностики.

Введение в некоторые основные и

новейшие методы, основанные на ну-
клеиновых кислотах, применительно к
фитосанитарной диагностике, приво-
дится далее.

5.1.5.1 Выявление, основанное на

гибридизации

Гибридизация основана на принци-

пе соединения последовательностей
нуклеиновых кислот организма-мишени
(неизвестного) и тест-организма (извест-

ного) для того, чтобы произошел отжиг
(гибридизация) гомологичных последо-
вательностей, если они присутствуют, и
возник обнаруживаемый сигнал. Обыч-
но для этой процедуры требуется, чтобы
нуклеиновая кислота мишени или тест-
организма были прикреплены к физиче-

ской матрице, такой как нитроцеллюлоз-
ная мембрана. Детектирующим сигналом
может служить излучение или, приме-
няемая в последнее время, некоторая
форма химической реакции, основан-
ной на окрашивании. Последние разра-
ботки характеризуются значительными
изменениями основных свойств физи-
ческой матрицы и уменьшением разме-
ров детектирующего устройства. Микро-
матричный анализ служит примером
современного формата платформ для
гибридизации, которые могут содержать
десятки тысяч единиц гибридизации на
«отпечатке» тест-системы «Eppendorf». В
этих микроматричных системах после-
довательность каждой единицы детек-
ции может быть смоделирована, и, та-
ким образом, микроматричные анализы
можно настроить под требуемую детек-
цию. Примером такого типа технологии
для вирусов растений является проект
«BioChip» Министерства окружающей
среды, продовольствия и сельского хо-
зяйства Соединенного Королевства Ве-
ликобритании и Северной Ирландии
(http://biochip.rvc.ac.uk/), а на коммерче-
ской основе – система «ClonDiag» (http://
www.clondiag.com). Микроматричные
анализы обеих этих систем, приведен-
ных для примера, проводятся для иден-
тификации одного образца.

Во многих случаях, чтобы дать от-

вет на вопрос, необходимо исследовать
много образцов на выявление конкрет-
ного вредного организма карантин-
ного значения. В этих обстоятельствах
микроматричный анализ не подходит.
Более приемлемым методом для ана-
лиза большого количества проб с высо-
кой пропускной способностью является
спот-гибридизация нуклеиновых кислот
(NASH-гибридизация (nucleic acid spot
hybridization)). При помощи этого метода
много проб (часто импринт стебля) поме-
щается на матрицу (нитроцеллюлозную
мембрану), а затем наносится тест-зонд,
специфичный для вредного организма-

5. Диагностика

мишени, в условиях, подходящих для
гибридизации и формирования сигнала.
Этот метод и его применение очень по-
хожи на анализ ELISA и микроплaншеты.
Требуется опыт с NASH-гибридизацией
для интерпретации сигнала и определе-
ния различия между очень слабым по-
ложительным сигналом и отпечатком,
возникшим из-за изменения цвета, вы-
званного пробой.

5.1.5.2 Методы выявления, основанные

на традиционной полимеразной
цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в
реальном времени

Применение традиционной ПЦР и

ПЦР в реальном времени для диагности-
ки и определения характеристик вред-
ных организмов играет важную роль в
фитопатологии.

В полимеразной цепной реакции

ведется экспоненциальное копирова-
ние матричной последовательности
нуклеиновых кислот при помощи таких
термостойких ферментов как Taq ДНК-
полимераза в ходе циклов нагревания
и охлаждения, во время которых име-
ет место денатурация и отжиг ДНК, со-
ответственно. Направляемая природа
ПЦР, в основном, определяется после-
довательностью нуклеиновых кислот,
состоящей из коротких олигонуклеоти-
дов, называемых праймерами, которые
работают парами для «запуска» ПЦР-
реакции, а также температурой отжига.
Последовательность праймера опреде-
ляет участок матричной ДНК, который
будет амплифицирован. Когда инфор-
мация о последовательности известна,
праймеры могут быть сконструированы
таким образом, чтобы амплифицировать
участки-мишени; в других случаях они
могут конструироваться для амплифика-
ции в произвольном порядке. ПЦР РНК-
мишеней, таких как вирусы, требует про-
ведения этапа обратной транскрипции
для получения кДНК из матричной РНК

перед амплификацией ДНК. Общее опи-
сание полимеразной цепной реакции
(ПЦР) предоставлено НЦБИ. Документ
доступен по ссылке: http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/probe/docs/techpcr/ (последний
доступ осуществлен 17 сентября 2015 г.).

Ключевым результатом ПЦР являет-

ся образование большого количества
копий ДНК с последовательностью,
идентичной матрице. В зависимости от
строения праймеров в результате ПЦР
можно получить один или много про-
дуктов амплификации разных размеров.
Затем амплифицированную ДНК можно
использовать в дальнейшей работе (ре-
стрикционном анализе, секвенировании,
мечении) или визуализировать. Тради-
ционно продукты ПЦР визуализируются
на агарозном геле. Однако ПЦР в реаль-
ном времени, эволюционировавшая из
традиционной ПЦР, позволяет прово-
дить анализ продуктов в реальном вре-
мени посредством контроля химической
реакции, протекающей одновременно с
амплификацией. В ПЦР в реальном вре-
мени зонд, помеченный информативным
красителем, прикрепляется между прай-
мерами. При амплификации краситель
активируется, приводя к формированию
информативного сигнала. Для измере-
ния этого сигнала нет необходимости
открывать ПЦР-пробирку, что значитель-
но уменьшает какую-либо возможность
перекрестной контаминации.

В большинстве примеров диагности-

ка, основанная на ПЦР, опирается на по-
лучение одного продукта амплификации,
визуализируемого на агарозном геле или
посредством флуоресцентного считыва-
ния и фиксируемого как положительный
или отрицательный результат. К тому же,
при проведении более обдуманной ПЦР-
диагностики будет использоваться вну-
тренний контроль для проверки того, что
реакция протекает так, как предусмотре-
но, наряду со стандартными контролями,
которые используются для детекции лож-

но положительных и ложно отрицатель-
ных результатов. В традиционной ПЦР
внутренний контроль должен продуциро-
вать фрагмент, по размеру отличающийся
от фрагмента ДНК вредного организма, а
в ПЦР в реальном времени – должен ис-
пользовать иную химию красителей. Неко-
торые методы ПЦР также включают в себя
определение количества патогена на ос-
новании интенсивности сигнала по срав-
нению с внутренним стандартом.

Другие методы диагностики, основан-

ные на ПЦР, используют отпечаток фраг-
ментов амплификации, который характе-
ризуется и известен как специфический
для организма. Дальнейшая и основная
сфера применения ПЦР и диагностики
– это секвенирование амплифициро-
ванного фрагмента и затем сравнение
этой последовательности с известными
последовательностями, имеющимися в
«GenBank» или собственной библиотеке
последовательностей ДНК, используя та-
кой инструмент как компьютерная про-
грамма «BLAST».

Проведено много исследований, це-

лью которых было сравнить методы ПЦР
и ELISA. Опыт большинства лабораторий
свидетельствует о том, что метод ПЦР в
реальном времени в десять раз более
чувствителен, чем традиционный метод
ПЦР, и в сто раз чувствительнее ELISA.
Однако для обоих анализов – как ПЦР,
так и ПЦР в реальном времени требу-
ется специальное оборудование и рас-
ходные материалы; и хотя их стоимость
и снижается, она все равно превышает
расходы на ELISA, что может быть огра-
ничивающим фактором в части, касаю-
щейся начальных капитальных и теку-
щих расходов.

5.1.5.3 Петлевая изотермическая

амплификация (LAMP)

Как было упомянуто выше, один из

недостатков ПЦР – это стоимость специ-
ализированного оборудования, необхо-

димого для проведения четко контроли-
руемого термоциклирования, а в случае
с ПЦР в реальном времени, одновремен-
ного контроля флуоресценции. Петлевая
изотермическая амплификация (LAMP)
– это метод детекции специфических
последовательностей нуклеиновых кис-
лот, который потенциально может пре-
одолеть многие ограничения методов,
основанных на ПЦР. Благодаря способ-
ности LAMP амплифицировать целевую
последовательность нуклеиновых кис-
лот в изотермических условиях отпадает
потребность в оборудовании для термо-
циклирования, что позволяет проводить
анализы с использованием минималь-
ного количества оборудования (водя-
ного термостата или термоблока). Кро-
ме того, упрощенные методы детекции
продуктов амплификации способствуют
использованию методов, основанных на
LAMP, в полевых условиях или в услови-
ях меньшей обеспеченности ресурсами.

LAMP – это метод амплификации,

использующий две пары праймеров
(внутренние и внешние праймеры) и
ДНК-полимеразу, осуществляющую за-
мену цепочки с целью производства
продуктов амплификации, содержащих
петлеобразные участки, с которыми за-
тем праймеры могут связаться, что по-
зволяет амплификации продолжиться
без термоциклирования. Амплификация
ускоряется при помощи использования
дополнительного набора праймеров
(петлевые праймеры), связывающихся
с этими петлями, которые ориентиро-
ваны неправильно, что не позволяет
внутренним праймерам соединиться с
ними. Причиной высокого уровня спец-
ифичности является требование, чтобы
праймеры присоединили до 8 участков
последовательности-мишени. Метод
LAMP используется для выявления ряда
фитопатогенов.

Реакции LAMP синтезируют большое

количество продукта амплификации, де-

5. Диагностика

текцию которого можно провести при
помощи традиционного электрофореза
в агарозном геле, используя спектрофо-
тометрическое оборудование для изме-
рения плотности раствора, в реальном
времени используя интеркалирующие
флуоресцентные красители или визу-
ально оценивая изменения плотности и
цвета. Тогда как преимущество методов
детекции, основанных на визуальном ос-
мотре, заключается в том, что для них не
требуется никакого оборудования, оцен-
ка цвета или плотности раствора невоо-
руженным глазом является потенциаль-
но субъективной. Методы, не требующие
наличия оборудования, используемые
для однозначной детекции продуктов
реакции LAMP, позволили бы расширить
практическое применение LAMP для вы-
явления фитопатогенов за пределами
лаборатории. Одним из таких методов
является использование компактных
мобильных наборов LFD (анг. lateral flow
devices / иммунохроматографические
устройства) для детекции меток, встро-
енных в продукты амплификации.

Как и ПЦР метод LAMP можно ис-

пользовать для детекции РНК-мишеней
посредством включения этапа обрат-
ной транскрипции для синтеза кДНК из
матрицы РНК до начала амплификации;
обратная транскрипция и LAMP могут
проводиться в одной пробирке при од-
ной температуре. Поэтому к значитель-
ным преимуществам LAMP относятся
следующие: (i) возможность проводить
реакции амплификации в изотермиче-
ских условиях, при этом исключается
потребность в термоциклическом обо-
рудовании; (ii) высокая специфичность
является неотъемлемой частью меха-
низма, который требует узнавания ше-
сти участков (или восьми участков, если
используются петлевые праймеры) по-
следовательности-мишени для того,
чтобы произошла амплификация; и (iii)
эффективность амплификации, которая
синтезирует очень большое количество

продукта менее чем за 1 час, позволяя
использовать новые стратегии детекции.

5.1.5.4 Пиросеквенирование и

секвенирование следующего

поколения

Подходы, использующие ПЦР и

LAMP, руководствуются знаниями о по-

следовательностях, необходимых для

создания праймеров, а также на базо-

вом понимании того, каковым являет-

ся возбудитель заболевания. Одним из

ограничивающих факторов опоры на

знания о последовательностях является

ситуация, когда делается попытка иден-

тифицировать новый вредный орга-

низм или подтвердить, что в материале

вредные организмы отсутствуют. В этих

случаях необходимо использовать один

или более наборов праймеров с широ-

кой таксономической специфичностью

с надеждой, что они выявят вредный

организм, если таковой присутствует.

Однако при использовании этого под-

хода получение отрицательного ре-

зультата не снимает неопределенности,

поскольку неизвестный вредный ор-

ганизм генетически может очень отли-

чаться, а участкам-мишеням праймеров

может не хватать достаточной гомоло-

гии, чтобы могла начаться ПЦР. Новый

подход к диагностике, особая ценность

которого заключается в идентифика-

ции неизвестных вредных организмов

и подтверждении того, что материал

не заражен вредными организмами, –

это секвенирование следующего поко-

ления, использующее универсальные

праймеры и праймеры, направленные

на произвольно выбранные мишени,

для широкомасштабной амплификации

всех нуклеиновых кислот в пробе. Ко-

роткие продукты амплификации затем

секвенируются, и для анализа этих не-

больших последовательностей и их со-

единения в последовательности, длина

которых имеет потенциальное таксоно-

мическое значение, используется высо-

котехнологичное компьютерное про-

граммное обеспечение. Идентичность
построенных последовательностей
затем можно проверить, осуществив
поиск в известных базах данных по по-
следовательностям. Эта технология –
узкоспециализирована, ее применение
будет иметь место только в нескольких
лабораториях и будет обосновано толь-
ко в исключительных случаях.

5.1.6 Выбор подходящего метода

диагностики

Как только возникает необходимость

в проведении идентификации патогена,
необходимо уделить внимание выбору
подходящего метода диагностики. Также
следует уделить внимание оценке ресур-
сов для проведения анализов, которыми
лаборатория располагает в настоящее
время или которыми могла бы распола-
гать. Наличие отдельных единиц обору-
дования, например, прибора для ПЦР в
реальном времени, может быть одним из
первых вопросов для рассмотрения, но
дополнительно следует подумать и о дру-
гих факторах, относящихся к более широ-
кому спектру ресурсов, включая наличие
сотрудников и их соответствующие компе-
тенции, площадь лаборатории и постоян-
ное техническое обслуживание капиталь-
ного оборудования. Затем следует учесть
специальные требования к анализу, такие
как чувствительность, специфичность и
устойчивость, относительно выхода дан-
ных по анализу (данные по последова-
тельностям, данные по жизнеспособности,
качественные и количественные резуль-
таты). И наконец, также следует учесть
такие практические вопросы, как время,
необходимое для получения результата,
и стоимость отдельных анализов. Затем,
принимая во внимание все эти факторы,
можно начать изучать литературу для по-
иска различных существующих методов
диагностики. Полезно начать с поиска в
интернете, а затем в библиографической
базе данных, обычно с учетом типа требуе-
мого метода и целевого патогена.

5.2 Верификация новых методов

Как только будет выбран подходящий

метод диагностики, лаборатории потре-

буется произвести верификацию того,

что она сможет компетентно провести

анализ. В соответствии с ИСО 17025:2005

«лаборатория должна подтвердить, что

она может правильно использовать

стандартные методы, прежде чем при-

ступить к испытаниям или калибровке».

Этот процесс отличается от валидации,

которая является «подтверждением по-

средством исследования и предоставле-

ния объективного доказательства того,

что выполняются определенные требо-

вания к специфическому предполагае-

мому использованию» (Вайгерс / Weigers

2003, стр. 303). Верификация подразуме-

вает проведение ряда экспериментов с

использованием материала положитель-

ных и отрицательных контролей с целью

обеспечения того, что лаборатория мо-

жет достичь приемлемых предела обна-

ружения и повторяемости анализа.

5.3 Обучение персонала лаборатории

Для успешной и надежной диагности-

ки вредных для растений организмов,

важно, чтобы персонал имел (i) надлежа-

щую подготовку, (ii) возможность нараба-

тывать опыт и (iii) мог демонстрировать

компетентность. Может потребоваться

ряд обучающих занятий прежде, чем на-

ставник и стажер согласятся, что стажер

– компетентен выполнять задачи без

контроля за ним; все учебные занятия

должны быть задокументированы. Как

правило, предполагается, что специали-

сты по диагностике должны проработать

в диагностической лаборатории не ме-

нее двух лет прежде, чем они попытаются

осуществить полную диагностику (из-за

огромного количества растений, вредных

организмов, симптомов; опыт – это ключ к

выполнению качественной диагностики).

Все этапы обучения должны фикси-

роваться документально и должны охва-

тывать:

5. Диагностика

Этап 1. Чтение соответствующих ин-
струкций (например, СОП);

Этап 2. Наблюдение за выполнением
задачи, осуществляемым обученным
штатным сотрудником;

Этап 3. Выполнение задачи под кон-
тролем;

Этап 4. Оценка компетентности вы-
полнять задачу без контроля.

Во всех возможных случаях под-

тверждающие данные или опыт, исполь-
зуемые как часть процесса оценки ком-
петенции, должны быть документально
зафиксированы. Компетенция оцени-
вается посредством использования, по
мере возможности, хотя бы одного из
следующих способов:

эксперименты по диагностике наме-
ренно зараженного образца;

повторный анализ образцов, диагно-
стика которых была уже ранее прове-
дена;

анализ референтных материалов или
материалов для квалификационного
тестирования;

сравнение результатов наставника и
стажера.

Критерии приемлемости документи-

руются и, как правило, устанавливаются
на уровне допустимых пределов контро-
ля качества. Дата разрешения на выпол-
нение задач без контроля указывается
на оценочном формуляре наряду с под-
тверждением руководителя подразделе-
ния. Руководители подразделений долж-
ны гарантировать, что представленные
и задокументированные доказательства
являются верными и надлежащими.

Лаборатории будут часто стараться

участвовать в схемах квалификацион-
ного тестирования. Квалификационное
тестирование определяет качество вы-
полнения отдельными лабораториями
конкретных анализов или измерений и
используется для осуществления кон-
троля качества работы, постоянно про-

водимой лабораториями. Также оно

непрерывно предоставляет подтверж-

дающие данные о компетенции отдель-

ного специалиста.

5.4 Методики проведения

диагностики

Цель этого раздела – ознакомить с

методиками, необходимыми для выделе-

ния и идентификации предполагаемого

вредного для растений организма. Нико-

им образом в нем не приводится исчер-

пывающее руководство по идентифика-

ции вредных для растений организмов.

5.4.1 Бактериология

Представление о фитопатогенных

бактериях можно получить, ознакомив-

шись с работой Видавера А.К. и Ламбрех-

та П.А. «Бактерии как возбудители болез-

ней растений». Журнал «Справочник по

здоровью растений». 2004 г. / Vidaver, A.K.

& Lambrecht, P.A. 2004. Bacteria as plant

pathogens. The Plant Health Instructor.

(Идентификатор цифрового объекта

(DOI): 10.1094/PHI-I-2004-0809-01). Статья

доступна по ссылке: http://www.apsnet.

org/edcenter/intropp/pathogengroups/

pages/bacteria.aspx (последний доступ

осуществлен 17 сентября 2015 г.).

Работа должна проводиться в лабо-

ратории, располагающей приемлемыми

условиями изоляции для работы с ка-

рантинными вредными организмами.

Требуется следующее оборудование:

препаровальные лотки;

скальпели, ножи и секаторы;

70%-ный этиловый спирт;

рулон протирочной бумаги / проти-

рочные салфетки;

небольшой источник огня;

стерильные одноразовые 90-милли-

метровые чашки Петри;

0,1%-ный стерильный пептон или

0,85%-ный раствор NaCl;

стерильные одноразовые инокуля-

ционные петли объемом 1 μл и 10 μл;

стерильная дистиллированная вода;

питательная среда;

инкубаторы (28°C и 25°C ± 1°C, а также
21°C ± 2°C);

пакеты для автоклавирования.

5.4.1.1 Диагностика

Диагностика бактерий, возбудите-

лей болезней растений, включает в себя
осмотр, выделение, идентификацию и
подтверждение. Идентификация может
проводиться на уровне рода, вида или
подвида.

Бактериальные инфекции, поражаю-

щие растения, часто бывают сезонными.
Также на них влияют климатические ус-
ловия и агротехнические практики. Хо-
рошие фоновые знания этих факторов
необходимо приобретать в течение не-
скольких вегетационных периодов.

Описания симптомов и методов вы-

деления и подтверждения наиболее
распространенных бактериальных бо-
лезней растений можно найти в книге
«Методы диагностики бактериальных
болезней растений» / Methods for the
diagnosis of bacterial diseases of plants
(Леллиот и Стэд / Lelliot and Stead, 1991
г.), которая представляет собой важный
справочный материал. Другие полезные
и важные справочные материалы приво-
дятся в разделе 5.5.1.3.

Со всеми известными образцами,

имеющими симптомы, следует обра-
щаться как с карантинным материалом,
и утилизация отходов должна соответ-
ствовать местным процедурам.

Специалист по диагностике должен

подробно описать симптомы в лабора-
торной ведомости, включая диаграммы,
в соответствующих случаях. Можно сде-
лать фотографии перед проведением ра-
бот, разрушающих образцы.

Выделение

Со ссылкой на литературу принима-
ется клиническое решение касатель-

но того, какие роды бактерий, как
известно, вызывают проявление сим-
птомов у этого хозяина.

Отрежьте небольшое количество тка-
ни от лидирующего края с симптома-
ми (где здоровая ткань растения со-
прикасается с тканью с симптомами),
используя стерильные скальпели.
Если лидирующего края нет, то выде-
ление можно попробовать провести
из другой части растения, где, веро-
ятнее всего, будет много бактерий.

Замочите иссеченный материал в не-
скольких каплях стерильного (1%-
ного) пептона или соляного раствора
(0,85%-ного раствора NaCl), исполь-
зуя стерильную чашку Петри в каче-
стве чистой поверхности, оставьте на
несколько минут перед тем, как сде-
лать посев «штрихом» на среду.

Первичное выделение лучше все-
го проводить на низко-питательной
среде, чтобы подавить быстрый рост
сапрофитов. Большинство бактерий
можно успешно выделить на пита-
тельном агаре, однако, более селек-
тивная, более богатая питательная
среда может быть рекомендована в
случаях, когда предполагается при-
сутствие конкретных родов.

Укажите диагностический справоч-
ный номер и дату на основании чаш-
ки с агаром (не на крышке).

Осуществите посев «штрихом» иссе-
ченного материала на питательную
среду. Инкубируйте чашки с иноку-
лятом. Большинство родов фитопа-
тогенных бактерий инкубируют при
температуре 25°C ± 1°C в течение 48
часов. Однако, если осуществляется
выявление определенных бактерий,
могут потребоваться другие темпера-
туры (например, 28°C ± 1°C или 21°C ±
2°C). Для других медленно растущих
бактерий также могут потребоваться
более длительные сроки инкубации.

5. Диагностика

Идентификация

Осмотрите чашки с питательной сре-
дой после соответствующего периода
инкубации (48–72 часа) для выявле-
ния типичных бактериальных коло-
ний предполагаемых фитопатогенов.

В качестве руководства следует от-
метить, что большинство колоний
потенциально искомых патогенов,
скорее всего, будет наиболее много-
численным, но необязательно это бу-
дут первые видимые колонии, кото-
рые появятся через 24 часа.

Если никакие предполагаемые бак-
териальные возбудители болезней
не выделены, проведите повторную
оценку описания симптомов и при-
мите клиническое решение касатель-
но того, вызван ли симптом зараже-
нием организмами, не являющимися
бактериями, или он имеет физиоло-
гическую причину.

Когда бактериальная инфекция не
установлена, записывается заклю-
чение: «Первичные фитопатогенные
бактерии из представленного образ-
ца не выделены».

Отделите предполагаемые патогены
от смешанных популяций посред-
ством пересева на соответствующую
свежую среду и повторно инкубируй-
те при подходящей температуре.

Если колонии все еще смешаны, ис-
пользуя инокуляционную петлю
объемом 1 μл, возьмите небольшое
количество смешанной колонии и
перерастворите ее в 5 мл дистил-
лированной воды, затем, используя
петлю объемом 10 μл, сделайте посев
«штрихом» на свежую среду.

В случае с чистой культурой посейте
ее на более богатую среду, такую как
среда Кинга Б, поскольку она обе-
спечит более обильный рост и может
лучше поддержать жизнеспособ-
ность культуры.

В целом, при краткосрочном хране-
нии (1–3 недели) выращенные куль-

туры хранятся при 5°C или при ком-
натной температуре на агаре. Для
длительного хранения необходимо
подготовить глицериновые стоки с
бактериальной культурой на кера-
мических шариках при температуре
–20°C или –80°C.

Если удалось хорошо провести выде-
ление колоний предполагаемых па-
тогенов, следует переходить к этапу
идентификации.

Перед тем, как перейти к проведению
специализированных анализов (таких
как анализ профиля жирных кислот
или ПЦР), может быть полезно прове-
сти анализ по методу Грама (например,
анализ с гидроксидом калия (KOH)),
оценку морфологии и пигментации
колонии, анализ анаэробного роста,
оценку споруляции и оксидазный ана-
лиз, которые могут помочь различить
некоторые распространенные роды.

Подтверждение (постулаты Коха)

Полное подтверждение – это про-
явление патогенности бактерии на
требуемом хозяине с симптомами,
соответствующими первоначально
описанным, и последующее успеш-
ное повторное выделение бактерии
из этого хозяина и ее повторная иден-
тификация.

Для подтверждения введите иноку-
лят очищенной свежей идентифици-
рованной бактериальной культуры
в здоровые растения на корню, при-
надлежащие соответствующему виду
растений-хозяев, и выращивайте их
одновременно с незараженными
контрольными растениями.

Выращивайте инокулированные рас-
тения и наблюдайте за развитием
симптомов.

Проведите повторное выделение из
тканей с развившейся симптоматикой.

Подтверждение завершено, ког-
да бактерия выделена из хозяина и
идентифицирована.

Необходимо провести полную иден-

тификацию предположительно ка-

рантинного организма или нового,
или необычного обнаруженного ор-

ганизма, статья о котором заслужива-

ет публикации в рецензируемом на-

учном издании.

5.4.2 Микология

Представление о фитопатогенных

грибах можно получить, ознакомившись

с документом «Руководство по диагно-
стике болезней растений во Вьетнаме»,

раздел 7 «Таксономия грибов фитопа-

тогенов» / Diagnostic manual for plant

diseases in Vietnam. Section 7. Fungal

taxonomy and plant pathogens, который
доступен по ссылке: http://aciar.gov.au/

files/node/8613/MN129 part4.pdf (по-
следний доступ осуществлен 17 сентя-
бря 2015 г.).

Работа должна проводиться в лабо-

ратории, располагающей приемлемыми
условиями изоляции для работы с ка-
рантинными вредными организмами.

Требуется следующее оборудование:

препаровальные лотки;

скальпели и бритвы с односторонни-
ми лезвиями;

препаровальные иглы или одноразо-
вые гиподермальные иглы;

пинцеты;

стеклянные предметные стекла для
микроскопа;

стеклянные покровные стекла №2
(18х18, 22х22 и 18х50 мм или другие, в
зависимости от конкретного случая);

прозрачная самоклеящаяся лента
(скотч);

заливочная среда: лакто-глицерин;

окрашивающие вещества: трипано-
вый / хлопковый синий в лакто-гли-
церине;

чашки Петри, содержащие карто-
фельный агар с декстрозой (КАД) или
другая соответствующая среда;

термостойкие пробирки;

небольшой источник огня;

химические вещества для кипячения
корней: гидроксид натрия или ги-
дроксид калия (KOH);

гранулы-«кипелки», при наличии та-
ковых.

5.4.2.1 Диагностика

Важно точно описать симптомы до

проведения исследования (которое за-
частую является инвазивным и разру-
шающим), а затем приготовить материал
для исследования под биологическим
микроскопом с целью идентификации
любых грибных структур. Также можно
подготовить чистые культуры для содей-
ствия идентификации.

Первичный осмотр

Посмотрите в информационном лист-

ке, заполненном клиентом, подробные
сведения о хозяине, стране происхожде-
ния, уровне зараженности в процентном
выражении и комментарии.

Осмотрите образец невооруженным

глазом и отметьте все его повреждения,
такие как:

явно сухие и отмершие ткани;

изменение цвета листьев:

пожелтение (хлороз);

побурение (некроз);

окрашенный налет;

пятна или дырки в листьях:

симметричные;

неправильной формы;

с хлоротическим или обесцвечен-
ным ореолом;

деформация или задержка роста ли-
стьев или побегов;

побурение стебля или образование
язв;

отставшая в росте, искривленная, по-
черневшая или подгнившая корне-
вая система;

твердость клубней, луковиц или пло-
дов;

липкий экссудат, гуммоз.

5. Диагностика

Задокументируйте степень и место-

положение всех таких повреждений,
указанных выше, и затем поместите об-
разец под препаровальную лупу и уста-
новите наименьшее увеличение. Мед-
ленно осмотрите здоровую ткань, чтобы
можно было распознать наличие незара-
женной ткани (особенно листьев). Затем
осмотрите зараженный материал на вы-
явление любых грибных структур, доку-
ментально фиксируя их расположение,
встречаемость, форму и отношение к по-
раженным участкам. Решите, существует
ли закономерная связь грибных струк-
тур с симптомами.

Обнаружив грибную структуру, уста-

новите большее увеличение (до порядка
50-кратного), чтобы определить ее мор-
фологию (мицелий, конидиофор, споро-
дохий, пикнида, спорогонный мицелий,
апотеций, клейстотеций, перитеций и
т.д.), пигментацию (гиалиновая – бесцвет-
ная, ярко окрашенная или дематиоидная
– темно окрашенная) и местоположение
структуры на растении (на поверхности,
прорастающая, частично прорастающая,
выпуклая, утопленная, прорастающая из
устьица, поры и т.д.). После осмотра по-
верхности хозяина может возникнуть
необходимость разрезать образец (осо-
бенно это касается клубней, луковиц,
корней, стеблей и плодов) для того, что-
бы определить глубину проникновения
или степень повреждения.

Если установлено, какой участок сле-

дует исследовать, переходите к изуче-
нию материала с использованием свето-
вого биологического микроскопа.

Плодовое тело присутствует

Поместите небольшую каплю лакто-

глицерина (с красителем или без него)
на поверхность чистого стеклянного
предметного стекла для микроскопа. По-
местив материал образца под препаро-
вальную лупу, осторожно возьмите пробу
из нескольких предполагаемых грибных

плодовых тел кончиком тонкого лезвия
скальпеля или препаровальной иглы,
продезинфицированных в пламени спир-
товки, или новой стерильной гиподерми-
ческой иглы. Изучите предметное стекло
под препаровальной лупой, чтобы удо-
стовериться, что структуры были успеш-
но перемещены и правильно размещены
для осмотра (излишки материала хозяина
на этом этапе также могут быть удале-
ны при помощи препаровальной иглы).
Осторожно опустите стеклянное покров-
ное стекло соответствующего размера
на предметное стекло и слегка прижмите
его, чтобы удалить все пузырьки воздуха.
Если необходимо, придерживая предмет-
ное стекло за край, осторожно нагрейте
его над пламенем спиртовки до тех пор,
пока все воздушные полости не начнут
расширяться, уберите предметное стекло
от огня и положите на рабочую поверх-
ность стола для охлаждения. Это удалит
все воздушные полости, которые могут
появиться в дальнейшем, также поможет
очищению тканей заливочной средой.
Перенесите предметное стекло под све-
товой биологический микроскоп.

Воздушный мицелий, химический налет или
неизвестные структуры

Отрежьте небольшой кусочек про-

зрачной клейкой ленты, такой как скотч
(длиной до 30 мм), и клейкой стороной
приложите к материалу образца, затем
мягко прижмите ленту. Образец пато-
гена должен был приклеиться к ленте.
Поднимите ленту и затем поместите же-
лаемую часть (клейкой стороной вниз)
на маленькую каплю лакто-глицерина на
стеклянном предметном стекле для ми-
кроскопа. Мягко прижмите, чтобы уда-
лить пузырьки воздуха, а затем нагрейте
очень осторожно, чтобы не допустить
кипения, которое может растворить
клейкий материал. Дайте предметному
стеклу остыть и перенесите его под био-
логический микроскоп.

Наличие каких-либо структур не
наблюдается, но предполагается
присутствие грибов

Сделайте тонкий поперечный или

продольный срез ткани хозяина (с ли-
стьев, стеблей, корней, клубней и луко-
виц) при помощи скальпеля или бритвы
с односторонним лезвием, поместите его
в каплю красителя трипанового / хлопко-
вого синего в лакто-глицерине на пред-
метном стекле для микроскопа. (Кра-
ситель трипановый / хлопковый синий
используется, потому что он помогает
отличить материал хозяина от грибного
материала; последний обычно окраши-
вается в более темный синий цвет). Осто-
рожно опустите покровное стекло и на-
грейте предметное стекло, как описано
выше. Перенесите предметное стекло
под биологический микроскоп.

Тонкие молодые корни можно иссле-

довать целиком; однако любые старые,
более жесткие корни придется кипятить,
чтобы позволить красящему веществу
проникнуть в ткань и окрасить любые
грибные споры, содержащиеся в ней.
Подготовьте такие корни путем кипяче-
ния, как описано ниже.

Кипячение корней для проведения осмотра

Выберите предположительно за-
раженный участок корней, избегая,
если это возможно, чрезмерно за-
гнивших или распадающихся корне-
вых нитей. Отрежьте кусочки корня
длиной 3-6 см в количестве, соответ-
ствующем размеру образца.

Поместите корни в большую термо-
стойкую пробирку, заполните ее во-
дой в количестве, не превышающем
2,54 см от дна пробирки, и добавьте
4-6 гранул-«кипелок» (если таковые
имеются). Эти гранулы не очень важ-
ны, но они помогают минимизиро-
вать риск выплескивания горячего
содержимого из пробирки.

Добавьте 2-3 гранулы гидроксида на-
трия или KOH. (Не берите эти гранулы
голыми пальцами.)

Используйте держатель для проби-
рок, чтобы держать кипящую пробир-
ку над горелкой Бунзена или газовой
горелкой на среднем огне (спиртовая
горелка не достаточно горячая, по-
этому не используйте ее) и кипятите
корни в течение нескольких минут
для их размягчения и очищения, а за-
тем снимите с огня.

Поместите термостойкую пробирку в
пробирочный штатив до тех пор, пока
она не охладится в достаточной сте-
пени, чтобы можно было вынуть об-
разец для осмотра.

Как только образец остынет, помести-
те его в пустую чашку Петри, чтобы
облегчить выбор корня.

Используя пинцет, поместите пробу
небольшого количества прокипячен-
ного корня на предметное стекло и
добавьте 1–2 капли красителя трипа-
нового / хлопкового синего в лакто-
глицерине.

Поместите большое прямоугольное
(22х64 мм) покровное стекло на корни.

Мягко похлопайте по покровному
стеклу, чтобы примять корни для ос-
мотра.

Изучение препарата под биологическим
микроскопом

Если необходимо, настройте биологи-
ческий микроскоп для оптимального
разрешения и четкости изображения.

Выберите малое разрешение объек-
тива (например, 10-кратное) и поме-
стите образец.

Осмотрите образец при малом раз-
решении и убедитесь, что структуры
являются грибными.

Убедитесь в том, присутствуют ли
споры, и определите, как они образу-
ются, например, из мицелия, внутри
плодового тела.

5. Диагностика

Если расположение плодового тела
установлено, запишите его внешнюю
морфологию и параметры, а затем по-
пытайтесь вытолкнуть его содержи-
мое, мягко надавливая на покровное
стекло тупой препаровальной иглой.
Это можно очень осторожно сделать
на предметном столике микроскопа,
продолжая наблюдение при 10-крат-
ном увеличении, либо снять предмет-
ное стекло с микроскопа, поместить
его на рабочую поверхность стола и
очень мягко постучать по покровно-
му стеклу карандашом.

Повторно проведите осмотр при
большом увеличении и опишите мор-
фологию спор и спорообразующих
структур.

Может возникнуть необходимость
сделать тонкий срез плодового тела,
если нечетко видно прикрепление
спор. Это можно сделать с помощью
острой бритвы с односторонним лез-
вием или скальпеля.

Сравните морфологию и первичный
предположительный результат диа-
гностики образца со справочной ин-
формацией.

Окончательная диагностика возмож-
на на этом этапе; также воспользуй-
тесь предлагаемыми выбранными
справочными источниками для со-
действия диагностике.

Если грибной образец нельзя досто-
верно идентифицировать (по какой-
бы то ни было причине), в таком
случае перейдите к выращиванию
культуры предполагаемого гриба на
питательной среде для того, чтобы
упростить идентификацию.

Выделение грибов из растительного
материала

Первичное выделение может про-

водиться на агаре с проточной водой.
Кроме того, подавляющее большинство
широко распространенных фитопатоге-
нов и грибов, приводящих к порче, будут

очень хорошо расти на КАД. Его можно
приготовить из коммерческого препа-
рата. Для первого выделения в среду
можно добавить антибиотики, такие как
пенициллин и стрептомицин, для ней-
трализации любых бактерий. Темпера-
туру инкубирования можно выбрать на
основе того, что известно о грибе; наи-
более распространенные фитопатогены
достаточно хорошо растут при 17-22°C.

Продезинфицируйте скальпель на
огне или используйте новую бритву с
односторонним лезвием, чтобы отре-
зать небольшой кусочек (максимум
2–3 мм) ткани от лидирующего края
пораженного участка стебля, вну-
треннего некроза или пятна на листе.

Если вы не устанавливаете присут-
ствие

Phytophthora

, поместите часть

образца в 10%-ный раствор гипох-
лорита натрия на 2–5 минут. Или же
замочите материал в 50%-ном этило-
вом спирте на 10 секунд. (Этот метод
может использоваться даже в случае,
если предполагается присутствие

Phytophthora

). Ополосните стериль-

ной дистиллированной водой и про-
сушите между бумажными полотен-
цами.

Укажите справочный номер образца
и дату на основании чашки с агаром.
Если берется ткань с более чем одно-
го типа поражения, сделайте соответ-
ствующие пометки на чашке. Поме-
стите ткань на агар в каждую чашку,
позаботившись о том, чтобы кусочки
были равномерно распределены.

Инкубируйте в течение 5–7 дней, про-
водя осмотр каждые два дня для от-
слеживания роста культуры, и для
того, чтобы посмотреть, является ли
культура чистой. На ранней стадии
инкубирования ее можно пересадить
на свежую среду, если вместе с ней
растет нежелательный организм.

Если необходимо, посмотрите пред-
лагаемые справочные источники для
того, чтобы получить информацию о

любых дополнительных специальных
методах выращивания культур на пи-
тательной среде, которые могут по-
надобиться для последующей иден-
тификации.

Выделение грибных спор или плодовых тел

Возьмите образец инокулята подходя-

щего размера. Целесообразно оставить
небольшое количество оригинального
грибного материала на образце на слу-
чай, если выделение первой культуры бу-
дет неудачным. Поместите инокулят гри-
ба в центр чашки Петри со средой КАД.
Инкубируйте и проверяйте рост гриба
каждые два дня до тех пор, пока колония
не произведет споры. Для предотвраще-
ния высыхания агара чашки Петри можно
запечатать парафильмом или хранить в
неплотно закрытом пакете.

5.4.3 Вирусология

Представление о фитопатогенных ви-

русах можно получить, ознакомившись с
работой Гергерича Р.С. и Долья В.В. 2006 г.
«Введение в вирусы растений, невиди-
мый враг». Журнал «Справочник по здо-
ровью растений» / Gergerich, R.C. & Dolja,
V.V. 2006. Introduction to plant viruses, the
invisible foe «The plant health instructor»
(Идентификатор цифрового объек-
та (DOI): 10.1094/PHI-I-2006-0414-01).
Документ доступен по ссылке: http://
www.apsnet.org/edcenter/intropp/
PathogenGroups/pages/PlantViruses.aspx
(последний доступ осуществлен 21 сен-
тября 2015 г.).

Работа должна проводиться в лабо-

ратории, располагающей приемлемыми
условиями изоляции для работы с ка-
рантинными вредными организмами.

5.4.3.1 Диагностика

Осмотрите материал образца нево-

оруженным глазом и отметьте все сим-
птомы, такие как:

атипичный цвет;

карликовость или задержка роста;

изменение цвета листьев, например,

хлороз, мозаика, пятнистость, коль-

цевая пятнистость, пожелтение или

некроз жилок;

деформация листьев, например, ис-

кривление, сужение или эпинастия;

пигментация на стеблях, плодах и

корнях;

другие симптомы, такие как увядание

или потеря листьев.

Симптомы и фоновая информация,

такая как виды хозяев, наряду с опы-

том специалиста по диагностике, дадут

представление о потенциальном воз-

будителе. Однако потребуется провести

дальнейшие диагностические анализы,

чтобы подтвердить присутствие опре-

деленного вируса. Ввиду своей природы

вирусы, как правило, диагностируются

посредством инокуляции растений-ин-

дикаторов, серологических анализов и

анализов, основанных на нуклеиновых

кислотах. Также можно использовать

электронный микроскоп, но это требует

доступа к дорогому специализирован-

ному оборудованию и наличия обучен-

ного персонала.

Инокуляция хозяина-индикатора

Вирусы могут распространяться толь-

ко через повреждения. В случае с расте-

ниями механическая инокуляция – это

метод, используемый для их выявления

и диагностики. Однако важно отметить,

что не все вирусы переносятся с соком

растений.

Инокулят предполагаемого образца

вводится в здоровые травянистые рас-

тения-индикаторы, и все симптомы, ко-

торые могут развиться на этих индика-

торах, записываются спустя некоторый

период времени, который может растя-

нуться на дни или недели. В зависимости

от реакций на разных растениях-индика-

торах специалист по диагностике может

поставить конкретный диагноз. Суще-

5. Диагностика

ствует целый ряд вариаций метода ме-

ханической инокуляции в зависимости

от определенного вируса, присутствие

которого предполагается, или хозяина,

на котором он появляется. В результате,

используется многообразие разных рас-

тений-индикаторов и экстракционных

буферов.

Требуемое оборудование:

чистые пестик и ступка;

буферы для измельчения, например,

фосфатный буфер pH 7,0

;

этикетки для горшков;

карандаш;

поднос;

здоровые виды-индикаторы;

материал образца;

целит (диатомовая земля);

микрошпатель;

промывалка с проточной водой;

ведро, наполненное раствором ги-

похлорита натрия;

протокол лабораторных испытаний;

ватная палочка;

пипетка переменного объема 1–5 мл;

микродозаторы;

пакеты для измельчения.

К растениям-индикаторам, как пра-

вило, будут относиться

Chenopodium

amaranticolor, Chenopodium quinoa,

Nicotiana occidentalis

P1,

Nicotiana

benthamiana

Nicotiana clevelandii

. Дру-

гие растения также можно добавить в за-

висимости от хозяина, анализ которого

проводится, и предполагаемого вируса.

Выбирайте растения, имеющие не менее

шести настоящих листьев (кроме огурца,

у которого должен быть один настоящий

лист, и фасоли обыкновенной, у кото-

рой должны быть только семядоли). По-

местите растения-индикаторы в темное

место на 12–24 ч. до инокуляции, чтобы

увеличить их восприимчивость. Выбе-

рите на растении-индикаторе от двух

до четырех листьев хорошего размера.

Пометьте листья, в которые будет вво-

диться инокулят, проделав дырочку на

кончике каждого из выбранных листьев,

используя чистый микродозатор.

Инокулят готовится посредством из-

мельчения растительного материала в

буфере (и таком абразивном порошке,

как целит). Инокулят затем мягко втира-

ется в помеченные листья растений-ин-

дикаторов и смывается водой спустя 3–5

минут. Отрицательный (только буфер

для инокуляции) и положительный (ви-

рус, который является умеренно транс-

миссивным и производит четкие симпто-

мы на растениях-индикаторах) контроли

должны быть включены в каждую пар-

тию инокуляций. Обратите внимание,

что после каждой инокуляции рабочую

поверхность стола и оборудование не-

обходимо продезинфицировать раство-

ром гипохлорита натрия. Инокулирован-

ные растения должны быть помещены

в теплицу с температурой 15–18°C и ин-

кубироваться в течение 4–28 дней. Рас-

тения должны осматриваться два раза в

неделю на выявление симптомов и веде-

ния записи результатов.

Симптомы должны оцениваться с ис-

пользованием следующих критериев:

хозяин;

используемые растения-индикаторы;

реакции этих растений-индикаторов;

как локальные, так и системные пора-

жения;

время, ушедшее на появление реак-

ции.

Анализ на вирусы с использованием ELISA

ELISA – это иммунологический метод

диагностики определенных вирусов рас-

тений, разработанный Кларком и Адам-

сом / Clark and Adams (1977 г.). Он стал

одним из главных методов диагностики

вирусов растений, поскольку он позво-

ляет одновременно провести диагно-

Примечание: такие добавки в буфер, как поливинилпирролидон (PVP) и сульфит натрия важны для устранения

ингибиторов в растительном материале, который будет использоваться в качестве инокулята.

стику большого количества образцов,
является очень специфичным и количе-
ственным.

В сэндвич-варианте ELISA (DAS, анг.

double-antibody sandwich – двойной
сэндвич из антител) частицы вируса
захватываются и зажимаются между
фракцией иммуноглобулина G (IgG)
специфической антисыворотки и IgG,
который был помечен (соединен с)
ферментом при помощи щелочной
фосфатазы. Присутствие вируса
подтверждается добавлением субстрата
в щелочную фосфатазу и окрашиванием
в желтый цвет из-за продуктов распада
субстрата. Поглощение цвета измеряется
на колориметре при 405 нм.

Требуемое оборудование:

планшет для ELISA;

пипетки переменного объема для ох-
вата следующих параметров:

1–5 μл

5–50 μл

50–200 μл

200–1 000 μл

1–5 мл

восьмиканальная мультипипетка с
переменным объемом: 50–250 μл;

одноразовые микродозаторы соот-
ветствующих размеров;

экстрактор сока растений или аппа-
рат для измельчения;

планшетный ридер для колориме-
трических измерений, например,
планшетный ридер «Thermo Scientific
Multiskan FC»;

альбумин бычьей сыворотки;

порошок сухого обезжиренного мо-
лока;

4-нитрофенил фосфат динатриевая
соль гексагидрат;

фосфатно-солевой буферный рас-
твор с твином (ФСБРТ);

Твин-20;

антитела и конъюгаты;

буферы;

планы планшетов;

водостойкий фломастер;

пищевая пленка;

бумажное полотенце;

промывалка;

пакеты для измельчения.

Необходимо подготовить план план-

шета, чтобы составить схему размещения

образцов и контролей на 96-луночном

планшете. Она должна быть основана на

следующих аналитических критериях:

Анализ каждого образца должен про-

водиться в двух повторностях. Поэто-

му колонки планшета всегда должны

попарно выделяться на каждый ви-

рус (например, колонки 1+2 – ArMV,

колонки 3+4+5+6 – CMV, колонки 7+8

–TBRV).

Для каждого анализируемого вируса

должен быть, как минимум, один здо-

ровый и один зараженный контроль

(также закладываемый попарно).

В бумажном варианте плана планше-

та размещайте образцы и контроли в ко-

лонках планшета вертикально. Наверху

напишите, какая колонка (какие колон-

ки) будут использоваться для анализа

какого вируса. Используйте стандартный

план планшета, если возможно (в кото-

ром уже определено местоположение

здоровых контролей).

Примечание:

Для непрямых анали-

зов TAS-ELISA (TAS, анг.

triple-antibody

sandwich

– тройной сэндвич с анти-

телами) должен быть отдельный план

планшета, поскольку требуется больше

этапов процесса инкубирования (за ис-

ключением случаев, когда готовится

«коктейль», в котором соединяют моно-

клональное антитело и антивидовой

конъюгат и вносят их на планшет одно-

временно).

Процедура сэндвич-варианта ELISA (DAS,

двойной сэндвич с антителами)

Покрытие планшета:

Приклейте к планшету ELISA на-

клейку с номером планшета ELISA

5. Диагностика

РУКОВОДСТВО по оказанию фитосанитарных диагностических услуг (ФАО, Версия 1.1) - часть 6