содержание .. 2 3 4
Аминирование поверхности магнитных наночастиц для иммобилизации кардиопротективных препаратов и флуоресцентных красителей - часть 4
NaOH
H O
2
HCl
Рисунок 17 - Схема титрования
3.4.4 Определение количества сорбированных флуоресцентных
красителей
По окончании сорбции флуоресцентного красителя определяли его
количество. Для этого к промытому осадку добавляли 10 мл 0,1 Н раствора
гидроксида натрия и проводили десорбцию в течение 15 минут. Затем
раствор центрифугировали и брали по
1 мл надосадочной жидкости.
Полученный раствор анализировался на содержание флуоресцентного
красителя спектрофотометрическим методом.
Максимум длины волны поглощения определялся при помощи
спектрофотометра Unico 2802s и составил для ФЛН - 485 нм, для ИЦЗ -
700 нм (рис. 18, а, б).
На этих длинах волн проводилась калибровка зависимости степени
поглощения водных растворов от содержания обоих флуорофоров.
Поскольку максимум длины волны поглощения ФЛН перекрывается линией
поглощения катионов железа (рис. 18, в), а щелочь в свою очередь растворяет
некоторое количество МНЧ, для образцов МНЧ-ФЛН содержание
36
флуоресцентного красителя по этому методу оценить не удалось. Для
образцов МНЧ-ИЦЗ, напротив, катион железа не мешает определению
содержания флуорофора (рис. 18, г).
1.0
0.5
0.0
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Длина волны, нм
а
3
2
1
0
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Длина волны, нм
б
37
2
1
0
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Длина волны, нм
в
3
2
1
0
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Длина волны, нм
г
Рисунок 18 — Спектры поглощения водных растворов флуорофоров: а — ФЛН; б — ИЦЗ;
в — МНЧ-ФЛН; г — МНЧ-ИЦЗ
Для определения количества флуорофора спектрофотометрическим
методом проводилась калибровка зависимости оптической плотности
растворов от содержания ФЛН и ИЦЗ на соответствующих длинах волн.
38
Результаты калибровки для ФЛН приведены в таблице 3, ИЦЗ - в
таблице 4.
Таблица 3 - Калибровочные данные для ФЛН
Концентрация ИЦЗ (С), мг/мл
Оптическая плотность, D
0,005
0,4210
0,0025
0,2190
0,00166
0,1300
0,00125
0,1200
0,000625
0,0076
Таблица 4 - Калибровочные данные для ИЦЗ
Концентрация ИЦЗ (С), мг/мл
Оптическая плотность, D
0,03125
2,6860
0,015625
1,3180
0,0078125
0,5580
0,00390625
0,1750
По калибровочным данным были построены калибровочные графики и
получены уравнения линейной регрессии (рис. 19, 20). В дальнейшем эти
уравнения использовались для определения содержания флуорофора по
значению оптической плотности.
Поскольку для образцов с ФЛН количество красителя определить не
удалось, количество доступных аминогрупп определялось по емкости по
ИЦЗ.
39
D
0,5
0,5
0,4
y = 89,797x - 0,0187
0,4
R2 = 0,9806
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0,0
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
C, мг/мл
Рисунок 19 - Калибровочный график зависимости оптической плотности раствора от
содержания ФЛН на длине волны 485 нм
40
D
3,0
2,5
y = 91,601x - 0,1576
R2 = 0,9992
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
C, мг/мл
Рисунок 20 - Калибровочный график зависимости оптической плотности раствора от
содержания ИЦЗ на длине волны 700 нм
41
5. БЕЗОПАСНОСТЬ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ
5.1. Общие положения
Суть работы заключалась в поиске наиболее оптимального
аминирующего агента и подборе растворителей, в которых проводились
различные реакции. В данной работе использовались следующие реактивы,
требующие осторожного обращения при выполнении различных
экспериментов: МНЧ, АПТЭС, бензол, раствор 0,1Н NaOH, раствор 0,1H
HCl.
Для диспергирования МНЧ, синтезированных не накануне реакции,
использовался диспергатор УЗД-2, для получения мелкодисперсной фазы.
Очистку бензола делали с помощью установки для перегонки, которая
включает в себя колбонагреватель LOIP LH-225. Так же стоит обратить
внимание на тот факт, что при выборе бензола, в качестве растворителя,
реакция проводилась с использованием установки, имеющей жидкостный
термостат.
Описание установки по перегонке
Установка представляет собой грушевидную колбу, для размещения в
ней вещества, которое необходимо перегнать, под ней расположен
колбонагреватель, с помощью которого повышается температура
перегоняемого вещества, для отделения не нужных фракций. Сверху колбы
одевается насадка Вюрца, которая в верхней части содержит термометр
необходимый для определения температуры испаряемого вещества. Далее к
насадке Вюрца крепится прямой холодильник, суть которого конденсировать
пары вещества, для дальнейшего накопления последних в канонической
колбе.
51
Описание установки по синтезу МНЧ из бензола.
Установка состоит из жидкостного термостата, соединенного
силиконовыми трубками со стеклянной термостатируемой ячейкой, для
циркуляции воды, необходимой температуры с целью нагрева грушевидной
колбы, содержащей реактивы. В верхней части колбы крепится прямой
холодильник с насадкой Вюрца и термостатом. К насадке Вюрца крепится
каплеуловитель для накопления продуктов реакции.
5.2. Оценка риска и опасностей, связанных с разработкой
Бензол
-
токсичное
вещество,
относится
к
группе
легковоспламеняющихся жидкостей
1-го класса. Предельно допустимая
концентрация паров бензола в воздухе рабочей зоны 5 мг/м3. Перегонку
бензола необходимо осуществлять с учетом пределов перегонки для
углеводородов бензольного ряда по ГОСТ 12.0.003-2015 при температуре не
выше 120 ºС. Все действия с бензолом должны проводиться в вытяжном
шкафу.
Работая с нагревательными приборами, следует соблюдать правила
безопасности в соответствии с ГОСТ 12.2.092.-94.
Соляная кислота - негорючая и не пожароопасная жидкость, относится
к веществам 3-го класса опасности ГОСТ 12.1.007-76. Предельно допустимая
концентрация хлористого водорода в воздухе рабочей зоны
-
5 мг/м3.
Кислота оказывает прижигающее действие на слизистые оболочки и кожу,
сильно раздражает дыхательные пути.
Гидроксид натрия относится к вредным веществам
2-го класса
опасности по ГОСТ 12.1.007. Предельно допустимая концентрация аэрозоля
гидроксида натрия в воздухе рабочей зоны производственных помещений
-
0,5 мг/м3.
В следующем разделе приведены основные требования по
обеспечению безопасности при работе с бензолом, электронагревательными
приборами, а так же риска получения химических и термических ожогов.
52
5.3. Основные требования безопасности
1)
При использовании электронагревательных приборов стоит
выполнять требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.
2) При работе с бензолом требуется проводить испытания в вытяжном
шкафе в соответствии с ГОСТ 2706.13-74.
3) При работе с гидроксидом натрия персонал должен быть обеспечен
специальной одеждой и средствами индивидуальной защиты (костюм из
хлопчатобумажной ткани, резиновые сапоги, резиновые перчатки, защитные
очки, фильтрующий промышленный противогаз) по ГОСТ 12.4.121.
4) Во время работы с соляной кислотой следует применять
индивидуальные средства защиты, а также соблюдать правила личной
гигиены и не допускать попадания препарата на слизистые оболочки, кожные
покровы, а также внутрь организма.
5) Помещения, в которых проводятся работы с соляной кислотой,
бензолом и гидроксидом натрия, должны быть оборудованы общей
приточно-вытяжной механической вентиляцией; анализ препарата следует
проводить в вытяжном шкафу лаборатории.
53
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1.
Отработаны методы поверхностной модификации МНЧ
аминогруппами при помощи двух аминирующих агентов
- глицина и
АПТЭС. Для АПТЭС поставлен синтез из водной среды и из органических
растворителей.
2. Наличие аминогрупп подтверждено методами ИК-спектроскопии
полученных образцов.
3.
Определено содержание общего и доступного количества
аминогрупп при разных методах аминирования.
4.
Отработаны методы иммобилизации двух флуоресцентных
красителей индоцианина зеленого и флуоресцеина на поверхности
аминированных МНЧ.
5. Исследована in vitro возможность применения полученных
нанообъектов для флуоресцентной визуализации.
54
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Губин С. П., Кокшаров Ю. А., Хомутов Г. Б. [ и др.]. Магнитные
наночастицы : методы получения, строение и свойства // Успехи химии. −
2005. − Т. 74. − № 6. − С. 539-574.
2. Artemov, D., N. Mori, B. Okollie . MR molecular imaging of the Her-
2/neu receptor in breast cancer cells using targeted iron oxide nanoparticles //
Magnetic Resonance in Medicine. - 2003. - № 12 p. 403-408.
3. Characterization of Modified Magnetite Nanoparticles for Albumin
Immobilization / D.K. Kim, Y. Zhan, W. Voit [ и др.] // J. Magn. Magn. Mater. -
2001. - № 8. - p. 221 .
4. Synthesis and Characterization of Fe3O4 Coated on APTES as Carriers for
Morin-Anticancer Drug
/ X. Liu, Z. Ma, J. Xing, [ и др. ] // J. Magn. Magn.
Mater. - 2004. - № 11. - p. 270.
5. Ela.ıssari A., Bourrel V., Preparation and Characterization of
(3-
Aminopropyl)triethoxysilane-Coated Magnetite Nanoparticles // J. Magn. Magn.
Mater. - 2001. - № 19. - p. 225.
6. Gries H., Mutzel W., Zurth C. On the Nature of Interactions of Amino
Acids with Bare Magnetite Nanoparticles. // Magnetic particles for diagnostic
purposes. - 1998. - Т.3. - № 2. - p. 29-35.
7. Brinker C.J., Scherer G.W. Synthesis and functionalization of magnetite
nanoparticles with different amino-functional alkoxysilanes.
// The Physics and
Chemistry of Sol-Gel processing, Academic press Inc., San Diego, Ca. - 1990. -
№ 54. - p. 73-80.
8. White L.D., Tripp C. P. Synthesis and Studies of APTES Functionalized
Magnetite Nanoparticles // J. Colloid Interfacen Sci. - 2000. - № 24. - p. 232.
9. Kinetics of the Dissolution of Magnetite in Thioglycolic Acid Solutions /
P.A. Heiney, K. Gruneberg, J. Fang, C. [ и др. ] // Langmuir. -
2000. -
№ 4. - р.
34-37.
55
10. Hainig Kao, He Jin . Fabrication of Cyclodextrin-Functionalized Super-
Paramagnetic Fe3O4 Amino-Silane Core-Shell Nanoparticles via Layer-by-Layer
Method // APPLIED SURFACE SCIENCE. - 2009. - № 18. - р. 401-409.
11. Modification of the surface of superparamagnetic iron oxide
nanoparticles to enable their safe application in humans / R.C. Peter, J.S. Salek,
C.T. Sikorski [ и др.] // J. Am. Chem. Soc. - 1990. - № 38. - р. 112.
12. Lu A., Salabas E.L., Angew . Silicon-containing nanocarriers for
targeted drug delivery: synthesis, physicochemical properties and acute toxicity //
Chem. Int. Ed. - 2007. - № 87. - р. 46.
13. Lee J., Isobe T., Senna M. A new procedure for preparation of
polyethylene glycol-grafted magnetic iron oxide nanoparticles // J. Colloid Interf.
Sci. - 1996. - № 27. - р. 177.
14. Jeong U., Teng X., Wang Y. Accumulation of magnetic iron oxide
nanoparticles coated with different sized polyethylene glycol in murine tumors //
Adv. Mater. - 2007. - № 21. - р. 33.
15. Szejtli J. Versatile ferrofluids based on polyethylene glycol coated iron
oxide nanoparticles // Chem. Rev. - 1998. - № 42. - p. 98.
16. Characterization and in vitro cellular uptake of PEG coated iron oxide
nanoparticles as MRI contrast agent / M. Yamaura, R.L. Camilo, L.C. Sampaio [ и
др. ] // J. Magn. Magn. Mater. - 2004. - № 22. - р. 279.
17. Ferrofluid based on polyethylene glycol-coated iron oxide nanoparticles:
Characterization and properties / M. Ma, Y. Zhang, W. Yu [ и др.] // Colloids Surf.
A: Physicochem. Eng. Aspects. - 2003. -Т. 4. - № 7. - р. 212-214.
18. Banerjee S.S., Che D. Dextran and Polymer Polyethylene Glycol (PEG)
Coating Reduce Both 5 and 30 nm Iron Oxide Nanoparticle Cytotoxicity in 2D and
3D Cell Culture // Chem. Mater. - 2007. № 16. - р. 19-25.
19. In vitro and in vivo experiments with iron oxide nanoparticles
functionalized with DEXTRAN or polyethylene glycol for medical applications:
Magnetic targeting / G. Nelles, M. Weisser, R. Back [ и др.] // J. Am. Chem. Soc.
-
1996. - № 3. - р. 118-123.
56
содержание .. 2 3 4