|
|
|
содержание .. 45 46 47 48 ..
циклических нуклеотидов). Ген НСN2 встроили в аденовирусный вектор и ввели в клеточную культуру, что привело не только к повышению If, но и значительному увеличению количества бьющихся клеток [18]. Более того, при воздействии на них изопротеренолом (синтетическим
аналогом катехоламинов) эти клетки отвечали положительным хронотропным эффектом (ускорением сердечного ритма) и отрицательным
хронотропным эффектом на ацетилхолин, как обычно и происходит в здоровом организме. Значит, эти клетки потенциально способны
отвечать на физиологические команды [19]. Эксперименты продолжили на собаках, которым с помощью катетера вводили в левое предсердие аденовирусную конструкцию - AdHCN2 и зеленый флуоресцирующий белок, ген которого используется для синтеза цветной “метки”). Затем
стимуляцией блуждающего нерва (под наркозом) добились угнетения синусового ритма. Спустя четыре дня в области инъекции аденовируса
возник новый ритм, чего не происходило у контрольных животных, которым вводили только AdGFP или физиологический раствор [20].
Более того, в дезагрегированных клетках сердечной мышцы, полученных из места инъекции, выявлен пейсмекерный ток в 100 раз большей
плотности по сравнению с нативными кардиомиоцитами. Повторное введение AdHCN2 в желудочковую проводящую систему тех же собак спустя четыре-семь дней при угнетении синусового ритма приводила к появлению в месте инъекции устойчивого ускользающего ритма - около 60 ударов в минуту, более частого по сравнению с
контролем (рис.2) [21]. Повышенная экспрессия HCN2 подтверждена с помощью иммунохимических и биофизических методов [22]. Рис.2. ЭКГ собак, которым вводили аденовирусные конструкции с геном GFP (верхняя запись) и генами GFP и HCN2 [21]. До инъекции синусовый ритм у обеих собак был примерно одинаков. После его угнетения, что было вызвано стимуляцией блуждающего нерва (время стимуляции отмечено стрелками), возникал идиовентрикулярный ритм, причем у животного, которому вводили оба гена, он был
учащенным и возникал быстрее по сравнению с контролем. На увеличенных фрагментах записей видно, что в первом случае (AdGFP + AdHCN2) возбуждение зарождается в левом желудочке, а во втором (AdGFP) - в правом. Безусловно, из всех перечисленных подходов генной терапии обнадеживают только результаты последнего, поскольку только в этом случае возникал стабильно ускользающий идиовентрикулярный (собственно желудочковый) ритм приемлемого физиологического уровня и
получены доказательства ответов вызванного ритма на активацию автономных нервов и их медиаторов. И все же выбранная стратегия
вызывает некоторые сомнения, так как после прекращения синусового ритма и до появления идиовентрикулярного проходит от 5 до 30 с, что
с клинической точки зрения недопустимо. Неясно также, удастся ли с помощью инъекции аденовирусной конструкции добиться
продолжительной активности или она будет сохраняться лишь дни или недели. Сомнения вызваны кратковременной экспрессией гена, что
связано со свойствами аденовируса, в который его встраивают. Дело в том, что в ядре клетки-мишени геном аденовируса существует
преимущественно в эписомальной форме, т.е. в виде кольцевых внехромосомных молекул, которые в каждом цикле деления подвергаются
репликации с помощью ДНК-полимеразы клетки. Вирусная ДНК может встраиваться в линейной форме в геном инфицированной клетки, тем
не менее число эписомальных копий вирусной ДНК будет значительно больше, чем интегрированных, что активизирует иммунную систему и
приведет к возвращению преобразованной клетки в исходное состояние. Кроме того, аденовирусы - причина обычной простуды, поэтому,
возможно, некоторые люди будут уже иметь достаточно высокие уровни антител к аденовирусному капсиду (покрывающему белку), что
затруднит попадание AdHCN2 в клетку. Другие вирусные векторы, например, РНК-содержащие ретровирусы, хотя и обладают некоторыми
преимуществами (эффективностью передачи, геномной интеграцией, стойкой экспрессией) потенциально патогенны, поскольку обладают
онкогенными последовательностями. Клеточная терапия Открытие способности эмбриональных стволовых клеток трансформироваться по меньшей мере в 350 различных типов клеток послужило толчком к активному их изучению и открыло перспективы их использования в биологии и медицине, в том числе и кардиологии. Однако
предстояло научиться идентифицировать и выделять клетки-предшественники, которые после дифференцировки могут стать клетками
необходимой линии. Опубликованные в 1999 г. в “Science” результаты экспериментов Д.Томсона и Дж.Беккера, которым удалось выделить
человеческие эмбриональные стволовые клетки и получить первые линии специализированных клеток, были признаны третьим по важности
событием (после открытия двойной спирали ДНК и расшифровки генома человека) в биологии ушедшего столетия. Когда выяснилось, что определенные подтипы эмбриональных стволовых клеток генерируют импульсы, сходные со спонтанными импульсами истинных водителей ритма, попытались использовать эти клетки в качестве биологических пейсмекеров [22]. Но и здесь
возникло немало проблем. Во-первых, поскольку незрелые эмбриональные стволовые клетки после прекращения дифференцировки могут утратить пейсмекерные характеристики, было бы большим достижением, если бы удалось останавить развитие полученных кардиомиоцитов на стадии
сино-атриальных клеток. Во-вторых, важно выяснить, какие каналы определяют спонтанный ритм пересаженных клеток, и убедиться, что это именно те каналы, которые обеспечивают работу истинных водителей ритма в сердце человека. Кроме того, надо знать, как созданная конструкция будет
отвечать на стимуляцию вегетативных нервов, т.е. определить чувствительность новых кардиомиоцитов к автономным нервным
воздействиям. Эти вопросы возникли в связи с потенциальной аритмогенностью создаваемых водителей ритма [23]. Ответив на эти вопросы,
можно понять: развитие аритмии в данном случае - артефакт (например, следствие экспериментальных манипуляций) или потенциально
опасное свойство биологических пейсмекеров, созданных на основе эмбриональных стволовых клеток. И наконец, не решена проблема
иммунного ответа организма на присутствие завершивших дифференцировку клеток. В этом отношении более перспективны, на наш взгляд,
мезенхимальные стволовые клетки, которые, как и эмбриональные, полипотентны (т.е. способны дифференцироваться в ряд клеточных
линий, включая клетки скелетных мышц и клетки соединительной ткани), но при этом, по-видимому, обладают “ иммунопривилегированностью” - на последних стадиях развития не вызывают существенного иммунного ответа [24]. Изначально стволовые клетки были обнаружены в костном мозге взрослого организма (точнее, в мезенхиме, или строме, костного мозга). Впоследствии оказалось, что они присутствуют практически во всех органах взрослых животных и человека; тем не менее обычно их
выделяют из костного мозга. Таким образом, появилась заманчивая перспектива: создание банка мезенхимальных стволовых клеток для
клеточной терапии различных патологий. В случае, когда по каким-либо причинам нельзя использовать донорские стволовые клетки, их
источником может служить собственный костный мозг пациента. Однако до того как это будет введено в практику, необходимо более
тщательно изучить биобезопасность, в частности “иммунопривилегированность”, стволовых клеток. Мы рассматривали мезенхимальные стволовые клетки взрослого человека в качестве основного экспериментального материала. Прежде всего нас привлекли стабильность клеточных линий и их низкая антигенность. Однако мезенхимальные стволовые клетки человека не способны
генерировать пейсмекерный ток If, поэтому необходимо было нагрузить их геном HCN2, который, напомню, отвечает за трансляцию синтеза
белков, формирующих и переносящих If. Сделано это было с помощью метода электропорации: клетки поместили в пульсирующее |