Другое (книга по генетике)

Другое (книга по генетике)

Если век Х1Х по-праву вошел в историю мировой цивилиза-

ции, как Век Физики, то стремительно завершающемуся веку ХХ,

в котором нам посчастливилось жить, по всей вероятности, уго-

товано место Века Биологии, а может быть и Века Генетики.

Действительно, за неполных 100 лет после вторичного открытия

законов Г. Менделя генетика прошла триумфальный путь от на-

турфилософского понимания законов наследствености и изменчи-

вости, через экспериментальное накопление фактов формальной

генетики к молекулярно-биологическому пониманию сущности ге-

на, его структуры и функции. От теоретических построений о

гене как абстрактной единице наследственности к пониманию его

материальной природы как фрагмента молекулы ДНК, кодирующей

аминокислотную структуру белка, до клонирования индивидуаль-

ных генов, создания подробных генетических карт человека и

животных, идентификации генов, мутации которых сопряжены с

тяжелыми наследственными недугами, разработки методов биотех-

нологии и генной инженерии, позволяющих направленно получать

организмы с заданными наследственными признаками, а также

проводить направленную коррекцию мутантных генов человека, то

есть генотерапию наследственных заболеваний. Молекулярная ге-

нетика значительно углубила наши представления о сущности

жизни, эволюции живой природы, структурно-функциональных ме-

ханизмах регуляции индивидуального развития. Благодаря её

успехам начато решение глобальных проблем человечества, свя-

занных с охраной его генофонда.

Естественно, что возможность манипуляции с индивидуаль-

ными генами человека и животных еще недостаточна для понима-

ния функции всего генома, его организации вцелом, взаимо-

действия его частей в обеспечении всего многообразия механиз-

мов онтогенеза, то есть развития одной клетки до целого орга-

низма. Если добавить к этому, что в геноме любого вида за-

писана не только программа индивидуального развития, но зако-

дирована и вся эволюция вида, то есть его филогенез, стано-

вится понятным насколько логичной и методически своевременной

явилась Международная научная программа "Геном человека". На-

ряду с аналогичными программами для других видов (лаборатор-

ные мыши, нематоды) программа Геном человека, начатая около

10 лет назад, уже к 2 000 году позволит полностью расшифро-

вать первичную структуру ДНК, то есть идентифицировать все

гены человека, их регуляторные элементы. Захватыающая Одиссея

о наследственности, которой и является эта программа, безмер-

но расширит наши представления о структуре и функции генома,

его эволюции, откроет горизонты столь увлекательного, а, воз-

можно, и не менее опасного направленного воздействия человека

на геном растений, животных и, что особенно рискованно, на

свой собственный геном. Важно осознать, что это не завтрешний

день фундаментальной науки, не отдаленные абстракции, но день

сегоднешний. Он уже наступил и стал реальным независимо от

нас, и, если не быть к нему готовым концептуально и методи-

чески, то пройдет помимо нас.

Предлгаемая вашему вниманию книга, действительно,

представляет собой введение в молекулярную генетику

наследственных болезней и рассчитана на достаточно широкую

аудиторию медиков и биологов. Для большинства из уже состояв-

шихся специалистов в этих областях - это реальная возможность

для самообразования, которой, увы, с годами мы так часто пре-

небрегаем, запутавшись в повседневных заботах. Для студентов

биофаков и особенно для студентов-медиков - эта книга вполне

может рассматриваться в качестве учебного пособия по молеку-

лярным основам медицинской генетики. Однако, и для первых и

для вторых, по глубокому убеждению авторов, много лет отдав-

ших внедрению достижений молекулярной биологии в медицинскуюя

практику, книга может служить в качестве справочного руко-

водства по молекулярной генетике человека. Действительно, ни

одна клиническая дисциплина (за исключением, может быть,

службы организации здравоохранения) не мыслима сегодня без

знаний и определенных навыков по молекулярной генетике. Ни

один биолог, занятый вопросами наследственности, изменчи-

вости, онтогенеза или эволюции независимо от конкретного био-

логического объекта, не может игнорировать человека, как од-

ного из пока немногих биологических видов с полностью

расшифрованной структурой генома. Быстро набирающая силы мо-

лекулярная медицина, преподование азов которой все еще явно

недостаточно для будущих врачей, на самом деле представляет

собой принципиально новый качественный уровень в понимании

вопросов этиологии, патогенеза, а, следовательно, и лечения

многих болезней, как наследственной моногенной, так и муль-

тифакториальной природы.

По нашему мнению, не только современный врач и специа-

лист-биолог, но и каждый образованный человек сегодня должен

знать о триумфе Международного Научного Сообщества в выполне-

нии программы Геном человека, в результате которой успешно

расшифровываются все гены человека, каждый из которых, будучи

выделенным из организма и проклонированным может выступать в

качестве лечебного препарата для генотерапии. О том, что уже

сегодня идентифицировано на генетических картах более 5 000

структурных генов и свыше 60 000 пока неизвестных смысловых и

анонимных ДНК последовательностей. О том, что всего за 5 лет

после первых успешных попыток введения чужеродных маркерных

генов в клетки человека in vivo, число уже одобренных для

клинических испытаний программ по генной терапии наследствен-

ных заболеваний достигло более 100! Эти итоги представляются

особенно впечетляющими если учесть, что согласно данным Все-

мирной Организации Здравоохранения около 2,4% всех новорож-

денных на земном шаре страдает теми или иными наследственными

нарушениями; около 40% ранней младенческой смертности и инва-

лидности с детства обусловлены наследственной патологи-

ей. Нельзя не упомянуть о реальных достижениях молекулярной

генетики в расшифровке наследственных факторов таких бичей

человечества как ишемия сердца, атеросклероз, диабет, онколо-

гические и инфекционные заболевания. Адекватно воспринимать

происходящую на наших глазах революцию в биологии и в медици-

не, уметь воспользоваться её заманчивыми плодами и избежать

опасных для человечества соблазнов - вот что необходимо се-

годня и врачам, и биологам, и представителям других смежных

специальностей, и просто образованному человеку.

Именно эта цель, эта сверхзадача, поставлена перед дан-

ной монографией, восполняющей, по мнению авторов, наметив-

шийся в отечественной научной литературе пробел в области мо-

лекулярных аспектов медицинской генетики и генетики человека.

Отдельные обзоры, монографии (Шишкин, Калинин, 1993), пере-

водная литература по молекулярной биологии и даже обстоятель-

ные сводки, подводящие ежегодные итоги работ по программе

"Геном человека" достаточно фрагментарны и касаются лишь от-

дельных аспектов проблем генодиагностики и генотера-

пии. Рассчитаны преимущественно на специалистов по молекуляр-

ной биологии. Задача данной монографии не только осветить

современное положение дел в молекулярной диагностике и лече-

нии наследственных болезней методами генной терапии, но,

главным образом, подготовить читателей, прежде всего врачей и

биологов, к пониманию и восприятию этой методически и концеп-

туально достаточно сложной обасти генетики.

Для достижения поставленной цели нам представлялось ло-

гичным начать изложение материала с описания структуры и сов-

ременных методов анализа ДНК, с общих представлений о её кло-

нировании, секвенировании, геномных библитеках (Глава I).

Глава II полностью посвящена структуре генома человека, новой

трактовке понятия "ген", генным семействам, вариабильным

структурам генома. Генетические карты, принципы их построе-

ния, функциональное и позиционное картирование, молекулярные

маркеры, современные достижения в разработке физических и

хромосомных карт человека и в картировании генов, ответствен-

ных за наследственные заболевания рассмотрены в Главе III.

Глава IV целиком посвящена описанию молекулярных методов де-

текции как уже известных мутационных изменений в структурных

генах, так и методов сканирования предполагаемых мутаций оп-

ределенных генов. Описание прямых методов идентификации му-

таций дополнены косвенными методами, основанными на молеку-

лярном маркировании мутантных генов. Все эти методы, как

прямые, так и косвенные, составляют основу молекулярной ди-

агностики моногенных наследственных болезней, широко исполь-

зуются в генетике человека при построении генетических карт,

исследовании проблем филогенеза, в популяционной гентике и в

геномной дактилоскопии, то есть для идентификации личности.

Подробному анализу внутренних (эндогенных) факторов мутаге-

неза, а также принципам популяционного анализа мутаций

посвящена Главе Y. Основные подходы, используемые при изуче-

нии экспрессии генов в модельных бесклеточных системах, на

уровне отдельных клеток и целых организмов приведены в Главе

VI. Принципы молекулярной диагностики наследственных болез-

ней и, в частности, пренатальной диагностики, а также осо-

бенности выявления гетерозиготного носительства в семьях

выского риска, изложены в Главе VII. Небольшая по размеру,

но важная также и для понимания принципов генной терапии

Глава VIII касается искусственного создания генетических мо-

делей наследственных заболеваний, в частности на базе

трансгенных живоных. Описаны используемые при этом методы

направленного переноса чужеродных генов в эукариотические

системы. В Главе IX изложены основы генотерапии наследствен-

ных заболеваний, рассмотрены методы доставки чужеродной ДНК

в клетки человека in vitro и in vivo, преимущества и не-

достатки существующих векторных систем (физических, хими-

ческих и биологических), их конструирование, преспективы

создания "идеальных" векторных систем. Кратко рассмотрены

итоги уже проведенных испытаний по генотерапии тех заболева-

ний, для которых Программы клинических испытаний уже одобре-

ны или находятся на стадии эксперимента. В заключительной

главе (Глава X) мы посчитали целесообразным подвести некото-

рые итоги и более подробно рассмотреть молекулярную диаг-

ностику трех групп наследственных заболеваний: (1) достаточ-

но полно изученную группу лизосомных болезней накопления;

(2) болезни экспансии (преимущественно нейродегенеративные

заболевания), вызываемые совершенно новым ранее неизвестным

типом так называемых "динамических" мутаций и (3) наиболее

частые, социально значимые наследственные заболевания, по

пренатальной диагностике которых молекулярными методами уже

накоплен достаточно большой опыт в нашей лаборатории и в

других медико-генетических центрах России.

Итак, предлагаемая монография рассчитана на достаточно

широкий круг читателей, но, прежде всего, на медиков и биоло-

гов, а также специалистов смежных профессий. Нам хотелось бы

думать, что книга будет особенно полезной для студентов меди-

цинских институтов и академий, врачей курсов повышения квали-

фикации, сотрудников медико-генетических консультаций и цент-

ров, а также для студетнов-биологов, многие из которых, как

показывает наш опыт, пополняют ряды специализированных диаг-

ностических лабораторий, медико-генетических центров и инсти-

тутов.

ГЛАВА III

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ, ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ.

Раздел 3.1 Классификация генетических карт, оценка

сцепления.

Генетические карты определяют хромосомную принадлеж-

ность и взаимное расположение различных компонентов генома

относительно друг друга. Возможность построения таких карт

обусловлена двумя фундаментальными характеристиками генома:

линейным характером локализации генов в хромосомах (это оп-

ределяется линейностью молекулы ДНК) и относительной ста-

бильностью расположения облигатных элементов генома в преде-

лах вида. При построении генетических карт используют разные

подходы. В первую очередь, к ним относятся анализ генети-

ческого сцепления на основе определения частот мейотической

рекомбинации в информативных семьях и изучение особенностей

наследования признаков, сцепленных с маркерными хромосомными

перестройками. Во-вторых, исследование экспрессии генов или

поиск специфических последовательностей ДНК в клеточных гиб-

ридах, содержащих лишь часть генома человека - одну или

несколько хромосом или их фрагменты. В ряде случаев с этой

целью используют механический сортинг целых хромосом и даже

их относительно небольших участковв. Эти приемы позволяют

привязать картируемый ген к определенной хромосоме и даже к

определенному фрагменту хромосомы. С помощью комплекса весь-

ма тонких методов хромосомного анализа, прежде всего, мето-

дов гибридизации in situ (см. Главу I) удается картировать

отдельные гены на хромосомах человека часто с точностью до

одного бэнда. И, наконец, методами молекулярного анализа

осуществляют физическое картирование последовательностей

ДНК, локализованных в специфических участках хромосом. Затем

проводят идентификацию в этих последовательностях транскри-

бируемых областей, то есть генов, с последующей изоляцией и

клонированием соответствующих им полноразмерных молекул

кДНК. Каждый из рассмотренных этапов анализа структуры гено-

ма завершается построением карт генов, различающихся по еди-

ницам измерения расстояний между отдельными элементами этих

карт, масштабам, по насыщенности или степени детализации на

различных участках генома. Соответственно различают карты

сцепления, генетические карты, цитогенетические карты инди-

видуальных хромосом и физические или молекулярные карты оп-

ределенных участков ДНК. Для полной молекулярной идентифика-

ции отдельных элементов генома, то есть определения их гра-

ниц, структуры и нуклеотидной последовательности, необходимо

совмещение всех типов карт в местах локализации этих элемен-

тов.

Первым шагом на пути построения генетических карт явля-

ется формирование групп сцепления генов, контролирующих

различные наследственные признаки, и исследование их взаим-

ного расположения в этих группах. На следующем этапе опре-

деляют соответствие между генетическими группами сцепления

и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами или их

фрагментами. Цитогенетическую идентификацию хромосом прово-

дят с использованием методов дифференциальной окраски

(см.раздел 3.2). По мере появления все большего числа лока-

лизованных признаков эффективность построения генетических

карт значительно возрастает, так как увеличивается число

маркированных участков хромосом и, таким образом, появля-

ется возможность комбинированного использования различных

экспериментальных подходов для более подробного исследова-

ния этих участков.

Принципиальная схема картирования неизвестных генов,

представленная на Рис.3.1, включает следующие этапы. 1. Вы-

яснение группы сцепления; 2. Поиск ближайших фланкирующих

маркеров; 3. Определение физической области (ДНК-последова-

тельности), включающей искомый ген; 4. Клонирование набора

фрагментов ДНК, перекрывающих исследуемую область; 5. Выде-

ление из этого набора клонов, содержащих транскрибируемые

ДНК-последовательности, предположительно соответствующие

гену или его фрагменту; 6. Анализ специфических мРНК и кло-

нирование кДНК-последовательности; 7. Секвенирование и

идентификация самого гена (Wicking, Williamson, 1991).

Рассмотрим подробнее эту схему.

Построение карт сцепления основано на изучении про-

цессов расхождения и рекомбинации гомологичных хромосом в

мейозе. Генетические признаки, локализованные в разных хро-

мосомах, не сцеплены друг с другом, то есть передаются от

родителей детям независимо, и частота их рекомбинации (Q)

составляет 0.5. Это обусловлено случайным характером

расхождения гомологичных хромосом в мейозе во время редук-

ционного деления. Гены, локализованные в одной хромосоме,

рекомбинируют за счет кроссинговера, то есть за счет обмена

участками гомологичных хромосом в процессе их спаривания в

мейозе (Рис.3.2). При этом порядок генов не нарушается, но

в потомстве могут появиться новые комбинации родительских

аллелей. Вероятность кроссинговера между двумя генами за-

висит от расстояния между ними. Чем ближе гены расположены

друг к другу, то есть чем больше они сцеплены, тем эта ве-

роятность меньше.

Оценку сцепления между генами проводят на основании

статистического анализа сегрегации признаков в семьях с

разветвленными родословными. Чаще всего при этом используют

метод максимального правдоподобия (Kao, 1983), то есть

подсчитывают десятичный логарифм шансов - lod (log of the

odds), где шансы (odds) выражаются как отношение вероят-

ности наблюдаемой родословной при условии, что два гена

сцеплены (0 < Q < 0.5), к той же вероятности при отсутствии

сцепления (Q = 0.5). Если значение lod > +3, гены локализо-

ваны в одной хромосоме, причем максимально правдоподобная

оценка соответствует максимальному значению lod. При значе-

ниях lod < -2 гены не сцеплены, то есть локализованы в раз-

ных хромосомах или на разных концах одной хромосомы. Ста-

тистическую обработку родословных обычно проводят с помощью

компьютерных программ, наиболее известные из которых прог-

раммы LIPED, CRIMAP и LINKAGE (Ott, 1985; Ott, 1991;

Terwilliger, Ott, 1994). На генетических картах сцепления

расстояние между генами определяется в сантиморганах (сМ).

1 сМ соответствует 1% рекомбинации. Общая длина генома че-

ловека в этих единицах составляет около 3300 сМ. Сопостав-

ляя эту величину с размером гаплоидного набора молекул ДНК,

можно заключить, что 1 сМ приблизительно эквивалентен 1

миллиону пар нуклеотидов. Такие расчеты, однако, весьма

приблизительны, так как частоты рекомбинации, а значит и

реальная длина одного сМ, могут сильно варьировать в раз-

личных частях генома. Существуют, так называемые, горячие

точки рекомбинации, также как и районы генома, где рекомби-

нация подавлена (центромерные и теломерные участки хро-

мосом, блоки конститутивного гетерохроматина и др.). Из-

вестно также, что частота рекомбинации у мужчин меньше, чем

у женщин, так что общая длина мужского генома, измеренная в

единицах рекомбинации, составляет лишь 3000 сМ. Таким обра-

зом, генетическое расстояние может дать лишь весьма ориен-

тировочную информацию о физическом (реальном) расстоянии,

выражаемом в парах нуклеотидов.

Раздел 3.2 Соматическая гибридизация, цитогенетический

анализ, картирование анонимных последова-

тельностей ДНК.

До начала 70-ых годов построение генетических карт че-

ловека продвигалось очень медленными темпами. Небольшой раз-

мер семей, длительный период одного поколения, ограниченное

число информативных родословных и отсутствие методов эффек-

тивного цитогенетического анализа всех пар хромосом затруд-

няло целенаправленное картирование генов человека. Достаточ-

но сказать, что 1-й ген человека - ген цветной слепоты был

картирован на Х-хромосоме в 1911г., а 1-й аутосомный ген-

только в 1968г. К 1973г. на хромосомах человека было карти-

ровано всего 64 гена, а к 1994 на генетических картах чело-

века было локализовано уже свыше 60 000 маркерных ДНК

последовательностей, в том числе около 5 000 структурных

генов - Рис.3.3. Столь стремительный прогресс в картирова-

нии генов человека связан с появлением новых технологий в

цитогенетике, в клеточных культурах и особенно в молекуляр-

ной генетике.

Техника соматической гибридизации, то есть возможность

экспериментального конструирования способных к размножению

межвидовых клеточных гибридов, явилась одним из наиболее

мощных инструментов для нахождения связей между группами

сцепления и цитогенетически идентифицируемыми хромосомами и

даже их отдельными сегментами. Гибридные клоны получают пу-

тем искусственного слияния культивируемых соматических кле-

ток разных видов, в частности, клеток человека и различных

грызунов - китайского хомячка, мыши, крысы (Шея,1985).

Культивирование таких соматических гибридов, как оказалось,

сопровождается утратой хромосом человека. Так были получены

панели гибридных клеточных клонов, содержащих всего одну

или несколько хромосом человека и полный набор хромосом

другого вида. Обнаружение человеческих белков, специфи-

ческих мРНК или последовательностей ДНК в таких клонах поз-

воляет однозначно определить хромосомную принадлежность

соответствующих генов. Таким способом удалось локализовать

более 250 аутосомных генов человека (Kao, 1983).

Дальнейший прогресс в области генетического картирова-

ния в значительной степени ассоциируется с деятельностью

многих научно-исследовательских центров и лабораторий по

созданию банков клеточных культур, представляющих наиболее

интересные и обширные родословные. Так, в Центре по Изучению

Полиморфизма Человека (CEPH) (Париж, Франция) была создана

уникальная коллекция перевиваемых клеточных культур от всех

членов семей, многоступенчатые родословные которых насчиты-

вают многие десятки и даже сотни индивидуумов (CEPH-семьи)

(Todd,1992; Weissenbach et al,1992). Перевиваемые линии кле-

ток получали из первичных культур, трансфорированных вирусом

Эпштейн-Барра, после чего такие лимфобластозные клетки ста-

новятся "бессмертными", то есть могут неограниченно долго

поддерживаться в условиях культивирования. CEPH-семьи

представляют собой идеальные системы для генетического ана-

лиза наследственных признаков. В результате исследования

этих клеточных линий определены генотипы членов CEPH-семей

одновременно по тысячам полиморфных локусов и построены

соответствующие генетические карты. Кроме того, совместными

усилиями многих лабораторий мира были созданы Банки Клеточ-

ных Культур, в которых поддерживаются коллекции лимфоб-

ластозных линий клеток, полученных от членов наиболее инфор-

мативных семей, в которых наблюдается сегрегация по различ-

ным наследственным признакам, в том числе по моногенным за-

болеваниям. Материал этих линий в виде клеточных клонов или

образцов ДНК используется, в частности, для анализа сцепле-

ния сегрегирующих генов с известными генетическими маркерами

или с вновь описанными полиморфными локусами. Таким образом,

во многих случаях при картировании генов человека удается

преодолеть ограничения, связанные с недостатком обширных ин-

формативных родословных.

Наконец, в начале 70-х годов появилась реальная возмож-

ность точной идентификации не только всех хромосом в карио-

типе человека, но и их отдельных сегментов. Это связанно с

появлением методов дифференциального окрашивания препаратов

метафазных хромосом, которые, по сути, произвели революцию в

цитогенетике и хромосомологии. Для получения дифференциаль-

ной окраски хромосомные препараты окрашивают некоторыми флю-

орохромами, либо, после соответствующей протеолитической об-

работки или нагревания, - красителем Гимза. При этом на хро-

мосомах выявляется характерная поперечная исчерченность, так

называемые бэнды, расположение которых специфично для каждой

хромосомы. На метафазных хромосомах малой степени спирализа-

ции идентифицируется около 750 таких полос, на прометафазных

хромосомах 2 500 - 3 000. Следовательно, величина небольших

бэндов на прометафазных хромосомах примерно соответствует 1

сМ на цитогенетических картах или 1 миллиону пар оснований

на физических картах. Такие ориентировочные рассчеты, как

уже упоминалось, оказываются полезными при сопоставлении

масштабов различных генетических карт.

Согласно официально утвержденной номенклатуре

(ISCN,1971) каждая хромосома человека после дифференциальной

окраски может быть разделена на сегменты, нумерация которых

начинается от центромерного района вверх (короткое плечо -

р), либо вниз (длинное плечо - q) (Рис.3.4). Полосы в каждом

сегменте также пронумерованы в аналогичном порядке. Крупные

полосы зачастую подразделяются на несколько частей, соот-

ветствующих более мелким бэндам, выявляемым только при ок-

раске малоспирализованных прометафазных хромосом. Запись по-

ложения гена на цитогенетической карте включает номер хро-

мосомы, плечо, а также номер сегмента, бэнда и его субъеди-

ницы. Например, запись 7q21.1 означает, что ген локализован

в субъединице 1, 1-го бэнда 2-го сегмента длинного плеча

хромосомы 7.

Такая подробная запись особенно удобна при использова-

нии для цитогенетического картирования метода гибридизации

in situ (см.Главу I), позволяющего локализовать ген с точ-

ностью до одного бэнда и даже его субъединицы. Основу данно-

го метода, как уже указывалось составляет гибридизация ге-

номной ДНК целых хромосом на разных стадиях их спирализации

с предварительно меченными специфическими ДНК-зондами.

Источником последних могут служить геномные последователь-

ности ДНК, сцепленные с картируемым геном, либо кДНК-овые

последовательности. В настоящее время из тканеспецифических

библиотек генов выделено около 20 000 анонимных последова-

тельностей кДНК, представляющих более 10 000 различных генов

человека (Sikela, Auffray, 1993). Эти кДНК составляют при-

мерно 10-15% всех кодирующих последовательностей генома. Ме-

тодом гибридизации in situ уже идентифицировано более 2000

генов, для многих из которых пока не найдено сцепление с по-

лиморфными маркерами (Poduslo et al., 1991). Такие кодирую-

щие последовательности присутствуют на карте генов человека,

но их пока нет на картах сцепления.

Раздел 3.3 Генетические индексные маркеры.

Как мы уже отмечали раньше, успешная локализация неиз-

вестного наследственного признака (гена) в значительной сте-

пени определяется присутствием на карте фланкирующих марке-

ров, находящихся на относительно небольшом расстоянии по обе

стороны от гена. В качестве генетических маркеров специфи-

ческих участков хромосом могут быть использованы любые лока-

лизованные в этих участках элементы генома с высоким уровнем

легко идентифицируемой популяционной изменчивости или поли-

морфизма. Отбор сцепленных с картируемым признаком генети-

ческих маркеров производят по результатам совместного анали-

за их сегрегации в информативных семьях.

Значительные успехи в геномном картировании были связа-

ны с использованием в качестве генетических маркеров широко

распространенной во многих популяциях изменчивости по изо-

ферментному спектру различных белков. Оказалось, что многие

ферменты у разных индивидуумов, в разных тканях и на разных

стадиях онтогенеза могут находиться в различных изоформах.

Такие варианты одного и того же белка обычно не отличаются

по специфической активности, но имеют измененную электрофо-

ретическую подвижность. Популяционный анализ изоферментов

обнаружил существование полиморфизма для очень многих белко-

вых систем, контролируемых разными генами, локализованными

во многих хромосомах. Таким образом, для этих хромосом были

найдены генетические маркеры, с помощью которых были иденти-

фицированы соответствующие группы сцепления.

Совершенствование молекулярных методов анализа специфи-

ческих последовательностей ДНК привело к обнаружению большо-

го числа высокоизменчивых участков генома - полиморфных сай-

тов рестрикции, гипервариабельных мини- и микросателлитных

последовательностей (см.Главу II) Эта изменчивость также бы-

ла использована для маркировки участков хромосом с целью

установления более точного взаиморасположения локусов. Вско-

ре после обнаружения полиморфных сайтов рестрикции были

опубликованы теоретические рассчеты, согласно которым от 10

до 20 таких локусов, расположенных равномерно на каждой хро-

мосоме на расстоянии около 20 сМ друг от друга, достаточно

для определения хромосомной принадлежности генов, от-

ветственных за любой тип наследственной изменчивости

(Botstein et al,1980). По этим оценкам около 200 таких ин-

дексных маркеров позволят построить карты сцепления для всех

известных генов на основании анализа сегрегации соответству-

ющих признаков в семьях с большим числом мутантов. Для опре-

деления порядка расположения генов на хромосомах и оценки

генетических расстояний между ними достаточно около 400 рав-

номерно распределенных полиморфных маркеров.

Идентификация в геноме человека большого числа поли-

морфных сайтов рестрикции и разработка простых методов ана-

лиза индивидуальной изменчивости по этим локусам существенно

повысили возможности локализации неизвестных признаков на

геномных картах. Уже к 1989г. были картированы более 2000

клонированных последовательностей ДНК, обнаруживающих поли-

морфизм по длине рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в различ-

ных популяциях (Kidd et al., 1989). Более 1000 из них типи-

ровано в CEPH-коллекциях родословных. В значительной степени

это анонимные последовательности, связь которых со специфи-

ческими генами не установлена. Их наименования чаще всего

соответствуют названию отобранного из библиотеки генов кло-

на. В дальнейшем была разработана стандартная генетическая

номенклатура для обозначения используемых в качестве марке-

ров сегментов ДНК с неизвестной функцией. Первая буква D,

что значит ДНК, затем номер хромосомы, далее S для уникаль-

ных и Z для повторяющихся последовательностей и в конце но-

мер, идентифицирующий данный зонд в определенном районе ДНК.

Применение полиморфных сайтов рестрикции в качестве ге-

нетических маркеров имеет два ограничения: сравнительно низ-

кая информативность (частота гетерозигот не может превышает

50%- см. Главы II, Y) и неравномерное распределение

ПДРФ-сайтов по хромосомам. Этих недостатков практически ли-

шены гипервариабельные STR-сайты (ди-, три- и тетрануклеа-

тидные повторы). Использование микро- и минисателлитных ДНК

последовательностей в качестве индексных генетических марке-

ров открыло новую эру в построении карт сцепления генома че-

ловека. В настоящее время работа по идентификации высокопо-

лиморфных маркеров, перекрывающих весь геном и равномерно

распределенных по хромосомам практически завершенаа

(Weissenbach et al.,1992; Reed et al.,1994). Эта система

построена на базе динуклеотидных (C-A)n повторов.

(C-A)n*(G-T)n представляют собой наиболее частый класс

простых повторов, обнаруженных в геноме человека (за исклю-

чением An* Tn мультимеров). Такие повторы присутствуют при-

мерно в 1% колоний из геномных библиотек, сконструированных

на базе фрагментов длиной 300 - 500 п.о., которые образуются

после переваривания геномной ДНК эндонуклеазой Alu1. Более

90% из них оказываются полиморфными по числу копий в класте-

ре, причем в 70% локусов присутствует более трех аллелей. В

1992г. группе французских ученых под руководством Жана

Вайссенбаха удалось разработать систему идентификации с по-

мощью ПЦР индивидуальной изменчивости в местах локализации

(C-A)n повторов и на этой основе создать геномную карту из

814 высокополиморфных индексных маркеров со средним расстоя-

нием между ними около 5 сМ, получившую название

Genethon-коллекции микросателлитных маркеров (Weissenbach et

al., 1992). Для этого были просеквенированы более 12 000

фрагментов ДНК, выделенных из геномной Alu1-библиотеки путем

ее скрининга poly(dC-dA)*poly (dG-dT) ДНК-зондом. Праймеры

для амплификации подбирали из последовательностей ДНК, окру-

жающих повторы, используя для этого компьютерные программы.

Для дальнейшего анализа было отобрано около 3 000

(C-A)n-сайтов и проведена специфическая амплификация этих

участков у четырех неродственных CEPH-индивидуумов. На сле-

дующем этапе была определена хромосомная принадлежность по-

лутара тысяч наиболее информативных маркеров путем их иден-

тификации в панели из 18 соматических гибридных клонов, со-

держащих разные наборы хромосом человека. Детальная карта

сцепления индексных маркеров построена по результатам их ге-

нотипирования в коллекции 8 самых больших CEPH-родословных.

Предложенная система маркеров перекрывает все хромосомы, а

суммарное расстояние между ними соответствует примерно 90%

всего генома человека.

К 1994г. число индексных STR-маркеров было увеличено до

2 066, а средний интервал между соседними локусами уменьшен

до 2,9 сМ (Gyapay et al.,1994). В последнее время перспекти-

вы широкомасштабного картирования всего генома человека ста-

ли еще более значительны. Группой английских авторов под ру-

ководством Дж.Тодда была разработана система автоматического

скринирования 254 динуклеотидных маркеров, перекрывающих

весь геном человека со средним расстоянием между соседними

маркерами около 13 сМ. 80% этих повторов было отобрано из

Genethon-коллекции маркеров, остальные - из других источни-

ков (Genome Data Base, Baltimore). Амплификацию всех 254 по-

лиморфных сайтов проводили в 39 мультиплексных ПЦР (МПЦР),

причем используемые для этих целей олигопраймеры были мечены

четырьмя типами флюорохромов, так что аллели даже одинаково-

го молекулярного веса можно было различить на электрофорег-

рамме по цвету. В каждой из 39 МПЦР скринировали 7 - 9

STR-сайтов какой-то определенной хромосомы. Такие МПЦР-набо-

ры были разработаны для всех 22 аутосом и для Х-хромосомы.

Регистрация аллелей всех STR проводилась автоматическим

сканнером с использованием компьютерной программы Genotyper.

Только с помощью одного автоматического сканнера удается

проанализировать по этой схеме более 2.5 тысяч генотипов в

день! (Reed et al.,1994). Такая система уже сегодня открыва-

ет самые широкие возможности не только для генетического

картирования и создания подробных карт сцепления практически

любых моногенных заболеваний, но, что особенно существенно,

она делает реальной разработку стратегии картирования генов,

мутации которых предрасполагают к мультифакториальным забо-

леваниям, таким как диабет, гипертония, инфаркт миокарда,

психозы и многое другое.

Раздел 3.4 Хромосом-специфические библиотеки генов,

пульсирующий гель-электрофорез.

Используя столь обширную систему молекулярных маркеров

и проводя анализ сцепления на коллекциях клеточных культур

или на материале информативных родословных можно довольно

быстро привязать любой признак, особенно моногенный, не

только к определенной хромосоме, но даже к одному бэнду, оп-

ределить ближайшие фланкирующие маркеры и перейти не-

посредственно к позиционному клонированию с целью выделения

и идентификации самого гена. В этой связи важное значение в

картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим

подходам, являющимся принципиально важным звеном для успеш-

ного совмещения карт сцепления и физических карт целых хро-

мосом и их фрагментов.

Точность цитогенетического картирования определяется

степенью спирализации хромосом, характером использованной

метки и разрешающей способностью микроскопического оборудо-

вания. При картировании на стандартных метафазных хромосомах

и использовании радиоактивно меченых зондов точность карти-

рования ограничивается одним крупным бэндом или даже сегмен-

том хромосомы и составляет около 5-10 миллионов п.о. При

использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах

точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1

миллиона п.о.), а при работе со специально приготовленными и

растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50

тысяч п.о.(Boehringer Mannheim Mannual,1992). Тем ни менее,

даже при такой разрешающей способности цитогенетическое кар-

тирование дает лишь весьма ориентировочные результаты и обы-

чно рассматривается как 1-й этап физического картирования.

Значительно более точные результаты достигаются на 2-м

этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования.

Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на

рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 кб.

Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенети-

ческого и молекулярного картирования прямое сопоставление

этих типов физических карт практически невозможно.

Одним из способов преодоления этих трудностей является

конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как

уже упоминалось (см.Глава I,1.5) для приготовления таких

библиотек используют наборы клеточных линий соматических ги-

бридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, ме-

ханически отобранные путем проточной цитометрии. Для некото-

рых видов молекулярного клонирования удобнее оказались биб-

лиотеки генов, построенные из субхромосомальных фрагментов.

Получение таких фрагментов достигается путем целенаправлен-

ного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь

часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны

могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при кото-

рых механически, под контролем микроманипулятора может быть

вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы.

Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и

идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по раз-

мерам к единичным хромосомным бэндам. Это стало возможным

после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК

на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеоти-

дов (Estivill, Williamson, 1987).

Другим важным шагом на пути клонирования и анализа

больших субхромосомальных фрагментов ДНК явилась разработка

методов их разделения путем гель-электрофореза в пульсирую-

щем поле (Barlow, Lehrach, 1987; Smith, Cantor, 1986; Smith

et al., 1987). В соответствии со стандартными методами

электрофореза под действием однонаправленного постоянного

поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разде-

лять фрагменты ДНК размером не более 3 - 5 десятков килобаз.

Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем

изменении направления электрического поля происходит, по

-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных

скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переклю-

чения направления поля. При этом более короткие молекулы

легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в

геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего

гель-электрофореза, главным образом, связанные с геометри-

ческим расположением направлений полей - ортогональный,

гексогональный, инверсионный. При использовании любого из

этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от

50 кб до более, чем 9 миллионов п.о. Эффективность разделе-

ния фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от

условий проведения электрофореза (напряжение, температура

буфера, концентрация агарозы, время одного импульса). В ка-

честве маркеров для определения величины больших молекул ДНК

используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной

массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих

специфические последовательности, также может быть осущест-

влен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами. Разделенные и

идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из

геля и использованы для рестрикционного картирования, пост-

роения библиотек генов и для молекулярного клонирования с

целью идентификации и изоляции генных последовательностей. В

последнее время для изоляции крупных субхромосомальных сег-

ментов ДНК широко используется метод клонирования в

искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC, и построения

библиотек генов на основе YAC-векторов.

Раздел 3.5 Позиционное клонирование, прогулка и прыжки

по хромосоме, идентификация и изоляция генов.

Мы уже упоминали, что средние размеры гена составляют

около 10-30 кб, варьируя в широких пределах (см.Глава II.2.

4). Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов

и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар

нуклеотидов, также как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых

с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеаза-

ми, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых

минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к после-

довательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осущест-

вляют с помощью молекулярного клонирования, то есть получе-

ния набора фаговых или космидных клонов, содержащих относи-

тельно небольшие последовательности, насыщаяющие или пол-

ностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно

содержащий идентифицируемый ген (Рис.3.5). Затем проводят

упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположени-

ем инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя однов-

ременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью иденти-

фикации регуляторных или кодирующих областей генов. Позднее

мы подробнее остановимся на тех критериях, с помощью которых

можно различить транскрибируемые и нетранскрибируемые участ-

ки генома. Для молекулярного клонирования используют различ-

ные подходы (Iannuzzi, Collins, 1990). Прежде всего, это

насыщающее клонирование, то есть изоляция из хромосом-специ-

фических библиотек нескольких сотен клонов с целью картиро-

вания различными методами инсертированных в них фрагментов

ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализо-

ванными в заданном районе. Значительно чаще используется

тактика скринирования фаговых, космидных и YAC библиотек,

сконструированных из субхромосомальных сегментов ДНК, пред-

варительно отобранных на основании сцепления с различными

ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомальных

сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск

в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые

последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими

методами, получившими название "прогулки" и "прыжков" по

хромосоме.

"Прогулка" по хромосоме или скользящее зондирование

(Рис.3.6). заключается в последовательном отборе клонов, со-

держащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из опреде-

ленного района генома (Rommens et al.,1989). На первом этапе

проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцеп-

ленной с геном. После нахождения положительных клонов

последние сами служат зондами для изоляции других клонов,

содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Таким об-

разом, каждый раз отобранный фрагмент используется в качест-

ве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В ре-

зультате получют набор клонированных фрагментов ДНК, пол-

ностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных

клонов носит название "контигов". С помощью физического кар-

тирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно

установить степень перекрывания между соседними фрагментами

и соответственно упорядочить положение клонов в "контигах".

При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого

нового клона к участку ДНК, полностью перекрытому отобранны-

ми зондами, в среднем добавляется около 20 кб. Таким спосо-

бом, однако, редко удается пройти более 200 - 300 кб в одном

направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно

клонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса

поиска генных последовательностей американским исследовате-

лем Фрэнком Коллинзом, ныне президентом Программы Геном Че-

ловека, был разработан метод "прыжков" по хромосоме. Этот

метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в гено-

ме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка),

не изолируя при этом все промежуточные последовательности

ДНК (Collins, Weissman, 1984). Как видно на представленной

схеме (Рис.3.7), прыжки начинаются со стартового зонда, то

есть с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с

геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переварива-

ется редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются

большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыж-

ку. Затем, эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за

счет искусственного присоединения к их концам небольшого

маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов

сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими

рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов

ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следова-

тельно, и окружающие его концевые участки исходных крупных

фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаго-

вых или космидных векторах, получая библиотеку генов конце-

вых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг кло-

нов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах компле-

ментарные зонду последовательности соединены маркерным геном

с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка

поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сег-

менты ДНК также могут быть клонированы с использованием ме-

тода скользящего зондирования.

Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно

отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых

других последовательностей (Рис.3.7.) (Lindsay, Bird, 1987;

Rommens et al., 1989; Wicking, Williamson, 1991; Collins,

1992). Условно эти критерии могут быть разделены на три

группы. В первой группе исследуют структурные особенности

генных последовательностей. Вторая группа критериев основана

на поиске функциональных участков генов. В третьем случае

анализируют характер нуклеотидных последовательностей тести-

руемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков ге-

нов осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым

скринированием кДНК-овых библиотек. Функциональная диаг-

ностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping),

промоторных участков, поли-A сигнальных последовательностей,

а также перенос генов в иные конструкции и идентификацию в

них соответствующих транскриптов. И, наконец, поиск генов

может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных

фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклео-

тидной последовательности и сопоставлением её с присутствую-

щими в базах данных идентифицированными генами других видов

живых существ.

Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов,

представленные в геноме уникальными последовательностями,

достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует

высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми

генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан,

так называемый зоо-блот - скрининг клонированных последова-

тельностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную

гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов жи-

вотных - приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов,

птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последова-

тельности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в

инсертированных фрагментах ДНК CpG островков, часто маркиру-

ющих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно ге-

нов домашнего хозяйства ( см.Главу II,2.4), и исследуют на-

личие открытых рамок считывания -ORF (open reading frames).

Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть

осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей

нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клони-

рованные ДНК из этого интервала могут быть сразу использова-

ны для анализа РНК-транскриптов (Iannuzzi, Collins, 1990).

Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК

гену является идентификация гомологичных РНК транскриптов в

тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой

целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум

критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих

тканей, а также скринируют соответствующие кДНК-овые библио-

теки. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным

первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из

пораженных органов и тканей. При обнаружении последователь-

ностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою

очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления

всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К

сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридиза-

ция может не дать положительных результатов.

Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным крите-

риям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК,

являющиеся частями гена. Однако, всегда существует опасность

выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализован-

ного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные

доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК

специфическому гену. Такие доказательства могут быть получе-

ны, например, при определении нуклеотидной последователь-

ности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последова-

тельностью кодируемого этим геном белка. Веским доказа-

тельством в пользу правильности проведенной идентификации

гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в

изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих

соответствующим наследственным заболеванием. Так, например,

при идентификации гена муковисцидоза, у 70% больных в клони-

руемой кДНК последовательности была обнаружена однотипная

мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, реша-

ющим аргументом правильности идентификации нужного гена яв-

ляется успешно осуществленная с его помощью генокоррекция

первичного биохимического дефекта, выполненная на соот-

ветствующих культурах мутантных клеток, или получение стой-

кого терапевтического эффекта у трансгенных животных - био-

логических моделей данного наследственного заболевания.

Определение размера молекул мРНК, гибридизующихся с ге-

номными клонами, дает оценку суммарной величины гена. Эта

оценка имеет важное значение для реконструирования полнораз-

мерной кДНК. Её клонирование, по-сути, означает идентификаию

гена, так как позволяет определить его границы в геномной

ДНК, охарактеризовать его экзонно-интронную структуру и ре-

гуляторные элементы. Зная первичную нуклеотидную последова-

тельность кДНК, можно с уверенностью прогнозировать амино-

кислотную последовательность соответствующего белка и таким

образом определить первичное биохимическое звено в патогене-

зе соответствующего наследственного заболевания.

Описанный способ изучения молекулярных и биохимических

основ наследственных заболеваний получил название обратной

генетики, а сам процесс в отличие от традиционного пути от

белка к гену, так называемого функционального клонирования,

был назван позиционным клонированием, тем более, что термин

обратной генетики уже использовался ранее для обозначения

метода анализа функции гена путем направленного введения в

него мутаций (Collins, 1992).

Возможность использования функционального клонирования

зависит от доступности информации о белковом продукте и/или

о функции соответствующего гена. Для подавляющего боль-

шинства моногенных болезней определение первичного биохими-

ческого дефекта представляет собой очень трудную задачу

из-за недостаточного понимания функционирования огромного

числа клеточных ферментов, сложностей их взаимодействия,

низких концентраций, отсутствия эффективных методов выделе-

ния и очистки а, зачастую, даже из-за отсутствия сведений о

клетках - мишенях, в которых следует искать первичный биохи-

мический дефект. Поэтому на фоне стремительного роста данных

о структуре генома чеовека и, прежде всего, о насыщенности

генами и анонимными ДНК маркерами отдельных хромосом и их

сегментов, реальные соотошения функционального и позиционно-

го клонирования в идентификации генов, ответственных за

наследственные заболевания, быстро меняются в сторону бе-

зусловного доминирования последнего.

Успех позиционного клонирования определяется возмож-

ностями картирования гена, при этом функция гена исследуется

уже после его идентификации и клонирования. На рис. 3.8

представлена общая схема позиционного клонирования, за-

имствованная из работы Коллинза (Collins, 1992). Обычно, для

нахождения положения неизвестного гена на карте сцепления

используют 100 - 200 полиморфных маркеров. После обнаружения

хромосомной принадлежности картируемого гена более

точная локализациия может быть установлена с помощью при-

цельного отбора дополнительных индексных маркеров из опреде-

ленного цитогенетического сегмента. Картирование гена, оп-

ределяющего наследственное заболевание, может быть значитель-

но ускорено при наличии у какого-то больного цитогенетически

видимой структурной перестройки в области локализации этого

гена, чаще всего делеции или транслокации. Хотя такие паци-

енты, как правило, встречаются редко, но описание даже одно-

го такого случая может исключить необходимость картирования

гена путем последовательного анализа его сцепления с генети-

ческими маркерами целого генома и позволит перейти не-

посредственно к молекулярному клонированию. Именно таким об-

разом были идентифицированы гены хронического грануломатоза,

миопатии Дюшенна, ретинобластомы, X-сцепленной глухоты, ней-

рофиброматоза I, аниридии и некоторых других наследственных

болезней.

С другой стороны, в ряде случаев удается исключить дли-

тельный процесс молекулярного клонирования, используя метод

"кандидатного гена". Разработка методов, облегчающих нахож-

дение транскрибируемых областей генома, улавливание экзонов

и регуляторных участков генов, секвенирование и картирование

методами гибридизации in situ большого количества анонимных

кДНК последовательностей, изолированных из тканеспецифи-

ческих библиотек, все это в комплексе приводит к значитель-

ному увеличению степени насыщенности различных сегментов

хромосом известными генными последовательностями, среди ко-

торых и осуществляют поиск гена-кандидата. Большая роль в

этих исследованиях принадлежит также мутантным генетическим

линиям животных, моделирующим различные наследственные забо-

левания человека (см Глава VIII). Значительное сходство нук-

леотидных последовательностей кодирующих участков гомологич-

ных генов млекопитающих и человека, наличие большого числа

консервативных групп сцепления с наборами идентичных генов

позволяют успешно вести параллельные исследования геномов

человека и других животных, значительно ускоряющие эффектив-

ность поиска и молекулярного анализа индивидуальных генов

человека (Dietrich et al., 1994; Copeland et al, 1993).

Молекулярная идентификация генов открывает широкие

возможности для анализа тканеспецифической регуляции их

экспрессии в процессе развития организма на всех уровнях от

транскрипции до трансляции. Следуюшим этапом молекулярного

анализа является генотипирование мутаций и исследование тех

нарушений в структуре, локализации или в ферментативной ак-

тивности соответствующих белков, которые возникают в резуль-

тате изменений нуклеотидных последовательностей ДНК. Эти

проблемы более подробно освещены в следующих разделах книги.

Отметим только, что в настоящее время подобные исследования

стали возожны для многих сотен наследственных заболеваний

человека, для которых идентифицированы геномные последова-

тельности ДНК, соответствующие генам, и проклонированы пол-

норазмерные кДНК-последовательности.

Раздел 3.6 Каталог генов и генных болезней МакКьюсика.

Международная программа "Геном человека".

Огромный вклад в систематизацию и обобщение информации

о генетических картах хромосом человека, локализации и функ-

циях отдельных генов, и о структуре генома в целом, вносят

исследования, проводимые на протяжении последних 30 лет в

Университете Джона Хопкинса в Балтиморе под руководством

профессора Виктора МакКьюсика. Результатом этих исследований

является систематическое, с 2-х-годичным интервалом между

последними пятью публикациями, издание энциклопедий, содер-

жащих сводные данные о всех картированных генах человека и

связанных с ними наследственных болезнях под названием:

"Менделевсое наследование у человека: каталог человеческих

генов и генетических болезней" ("Mendelian inheritance in

man. Catalogs of autosomal dominant, autosomal recessive,

and X-linked phenotypes". Эти издания содержат современные

хромоcомные карты генов человека и для каждого локуса обоб-

щенные в виде отдельных статей сведения о характере наследо-

вания, функциях и размерах генов; методах их картирования и

идентификации; кодируемых продуктах; мутантных аллелях, по-

лиморфизмах и внутригенных повторах; фенотипических проявле-

ниях мутаций, их связи с наследственными заболеваниями, а

также о природе основного дефекта, включая патогенез и пато-

физиологию заболевания. Все статьи снабжены исчерпывающими

литературными ссылками. Cводные таблицы по картированным ло-

кусам с различным типом наследования и по генам наследствен-

ных заболеваний составлены либо в соответствии с их хро-

мосомной локализацией, либо в алфавитном порядке по названи-

ям генов или по наименованиям соответствующих генных болез-

ней. Отдельно представлены данные по клонированным генам,

для которых известен первичный молекулярный дефект. При этом

количество различных идентифицированных мутантных вариантов

для разных генов колеблется от одного до нескольких сотен.

Издания содержат также список доступных мутантных клеточных

линий.

Каждому локализованному менделирующему локусу в этой

энциклопедии присвоен шестизначный номер (MIM), первая цифра

которого определяет характер наследования: 1 - для аутосом-

но-доминантных генов, 2 - для аутосомно-рецессивных, 3 и 4-

для генов, локализованных в X- и в Y-хромосомах, соот-

ветственно, 5 - для митохондриальных генов. Четыре цифры,

следующие после точки непосредственно за шестизначным номе-

ром, предназначены для кодирования различных мутантных вари-

антов данного локуса. Издания выпускаются как в печатной

форме, так и в компьютерном варианте (OMIM) на дискетах или

на компакт-дисках. В последнем случае они снабжены програм-

мами, позволяющими осуществлять поиск по любой позиции и

проводить постоянное обновление энциклопедии текущей инфор-

мацией. Программы OMIM совместимы с другими базами генети-

ческих данных, в первую очередь, с GDB (Genome Data Base),

содержащей полную информацию (включая последовательности

ДНК) обо всех картированных генах, ДНК-маркерах и ДНК-зондах

человека, а также и с GenBank - полной базой данных всех из-

вестных нуклеотидных gоследовательностей ДНК.

В последнем 11-ом издании энциклопедии МакКьюсика со-

держатся сведения о 6678 картированных менделирующих локусах

человека (McKusick, 1994). Из них 4458 генов с аутосомно-до-

минантным характером наследования, 1730 - с аутосомно-ре-

цессивным, 412 генов локализовано в X-хромосоме, 19 - в

Y-хромосоме и 59 - в митохондриальной ДНК. Для более чем

2800 картированных генов определена их функция. С моногенны-

ми заболеваниями связано 770 картированных локусов, а общее

число нозологических форм, для которых гены картированы,

включает 933 заболевания. При этом более 420 генов

наследственных болезней уже клонированы и для каждого из

этих генов описано от одного до нескольких сотен мутантных

вариантов аллелей, характеризующихся различным фенотипи-

ческим проявлением.

Различные хромосомы и их участки картированы с разной

степенью детализации. На самой крупной по размерам хромосоме

1 картировано вдвое меньше генов, чем на Х-хромосоме ( 200 и

400 соответственно). Плотность уже картированных генов в

разных хромосомах очень неравномерна. Так, хромосома 19 со-

держит 178 генов, тогда как хромосома 13 только 40, при этом

первая больше второй. Хромосомы 17 и 18 примерно равны по

величине, но на первой уже картировано 180 генов, а на вто-

рой- только 26. На хромосоме 2 картировано примерно такое же

количество генов (около 175), как и на втрое меньше её по

размерам хромосоме 17. Существеные различия в числе картиро-

ванных генов отмечаются и внутри различных участков хро-

мосом. К примеру, 19 из 43 генов хромосомы 21 локализованы в

сегменте 21q22.3, составляющем лишь 20% длинного плеча. Об-

ласть 9q34 занимает 10% хромосомы 9, но содержит 27% генов -

38 из 141 (Antonarakis, 1994). Число подобных примеров не-

равномерного распределения картированных генов по хромосо-

мамс может быть значительно увеличено.

Более 10 лет тому назад был полностью просеквенирован

митохондриальный геном (Anderson et al., 1981), состоящий из

16 569 нуклеотидов и содержащий 37 генов, 22 из которых это

гены транспортных РНК, 2 гена рибосомальной РНК и 13 белко-

вых генов, кодирующих субьединицы комплексов окислительного

фосфорилирования (OXPHOS). Следует отметить, что 56 субьеди-

ниц этого комплекса кодируется ядерными генами (McKusick:

1994). Митохондриальная ДНК очень плотно насыщена кодирующи-

ми участками, так как митохондриальные гены не содержат инт-

ронов и имеют очень ограниченные размеры некодирующих флан-

кирующих ДНК. В настоящее время описано достаточно много бо-

лезней, связанных с мутациями в митохондриальном геноме, и

все они развиваются вследствие нарушений в системе окисли-

тельного фосфорилирования.

Мы уже упоминали о том, что в настоящее время проклони-

ровано около 20 000 анонимных последовательностей кДНК, вы-

деленных из тканеспецифических библиотек генов и представля-

ющих около 10-15% всех генов человека. Хотя этих последова-

тельностей пока нет на картах генов, секвенирование, со-

поставление с компьютерными базами данных и гибридизация in

situ позволят уже в самое ближайшее время провести их иден-

тификацию и локализацию (McKusick, Amberger, 1993).

Следует отметить, что каждый картированный ген и поли-

морфный локус сами по себе автоматически становятся точками

отсчета в геноме, то есть молекулярными маркерами. Наряду с

этим, продолжается интенсивное насыщение генома новыми моле-

кулярными маркерами типа STS ( sequence tagged sites) и мик-

росателлитными повторами типа STR (short tandem repeats)

(cм. Главу II). К сентябрю 1994г Genome Database (GDB) вклю-

чала 6691 STR-сайтов и 3 752 из них (56%) имели уровень ге-

терозиготности более 60%. Карты сцепления для индексных мар-

керов сконструированы, в основном, по результатам генотипи-

рования сорока CEPH референтных семей (см.Глава II,2.3).

Среднее расстояние между соседними маркерами варьирует от 2

сМ для хромосомы 21 до 5 сМ для самых крупных хромосом с

очень небольшим числом участков в геноме с расстоянием между

маркерами большим, чем 10 сМ. GDB содержит 672 гена, локали-

зованных на картах сцепления индексных маркеров, из общего

числа 3485 клонированных генов (Guapay et al., 1994). Соз-

данные в последние годы достаточно подробные геномные карты

сцепления молекулярных маркеров в масштабах 13, 0; 5,0 и да-

же 2,9 сантиморганид; автоматизация процесса генотипирования

маркерных микросателлитных (STR) аллелей; большое число уже

картированных структурных генов, анонимных ДНК-последова-

тельностей значительно упрощают и, главное, ускоряют процесс

генетического картирования. Если в 1992г. в распоряжении

иследователей было только 814 динуклеотидных полиморфных

сайтов (Weissenbach et al.,1992), то уже к маю 1994 г. их

число возросло до 3 300 (Guyapay et al.,1994) , а к концу

года - до 5 000- 6 000 (Shmitt, Goodfellow, 1994). Столь же

быстрыми темпами нарастает число молекулярных маркеров и в

геноме лабораторных мышей (Service, 1994). По всей види-

мости, человек и лабораторная мышь будут первыми млекопитаю-

щими с полностью расшифрованными геномами.

Картирование генов человека и выяснение первичной нук-

леотидной последовательности человеческого генома составляют

основные, взаимосвязанные задачи Международной программы

"Геном Человека". Официально эта научная программа с участи-

ем ведущих молекулярно-генетических лабораторий США, Запад-

ной Европы, России и Японии оформилась в 1990г. Однако, за-

долго до приобретения официального статуса, в этих странах

проводились важные молекулярные исследования по изучению ге-

нома человека и картированию его генов. История отечествен-

ной программы началась в 1987г. Её инициатором и безусловным

лидером в течение многих лет был академик А.А.Баев. По его

настоянию в 1989г. она стала одной из ведущих Государствен-

ных научно-технических программ СССР. Основные разделы этой

программы как в России, так и во всем мире включают три

главных направления научных исследований: 1. Картирование и

секвенирование генома; 2. Структурно-функциональное изучение

генома; 3. Медицинскую генетику и генотерапию (Баев,1990;

1994).

Предполагалось, что основной раздел программы, касаю-

щийся секвенирования всего генома, то есть выяснения первич-

ной последовательности всей молекулы ДНК одной клетки чело-

века длиной около 1,5 метров, состоящей из 3.5х10!9 нуклео-

тидов, будет завершен уже к 2 005 году. Однако, серьезные

технические усовершенствования этого трудоемкого процесса,

его автоматизация и резкое снижение себестоимости (от 1$ США

за один шаг в 1990г. до 0,2$ в 1995г.) позволяют надеяться,

что эта гигантская молекула, несущая информацию о всей прог-

рамме индивидуального развития человека и его эволюции будет

полностью расшифрована уже к 2 000 году ! (Marshall, 1995).

Естественно, что в итоге этой работы будут идентифици-

рованы и все гены человека, то есть будет точно определено

их число, взаиморасположение на генетической карте и струк-

турно-функциональные особенности. Предполагается, что осу-

ществление этого проекта, помимо колоссальных теоретических

обобщений для фундаментальных наук, окажет огромное влияние

на понимание патогенеза, предупреждение и лечение

наследственных болезней, значительно ускорит исследование

молекулярных механизмов, лежащих в основе развития очень

многих моногенных нарушений, будет способствовать более эф-

фективному поиску генетических основ мультифакториальных за-

болеваний и наследственной предрасположенности к таким широ-

ко распространенным болезням человека как атеросклероз, ише-

мия сердца, психиатрические и онкологические заболевания.

ГЛАВА X.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ

МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Раздел 10.1. Хромосомная локализация и принципы класси-

фикации генов наследственных болезней.

Раздел 8.1 Хромосомная локализация и принципы классифи-

К настоящему времени на хромосомах человека картирова-

но около 800 генов, мутации которых приводят к различным

наследственным заболеваниям. Количество моногенных заболева-

ний, для которых известна локализация контролирующего гена,

еще больше и приближается к 950 за счет существования ал-

лельных серий, то есть групп болезней, клинически сильно от-

личающихся друг от друга, но обусловленных мутациями в одном

и том же гене (см.Глава IV). Для всех этих заболеваний прин-

ципиально возможна пренатальная диагностика с использованием

косвенных методов молекулярного анализа (см.Главу VII).

Более половины картированных генов клонировано и оха-

рактеризовано методами молекулярного анализа. Для каждого из

этих генов описаны мутантные варианты среди соответствующих

групп больных, причем количество идентифицированных аллелей

в разных генах может колебаться от одного до нескольких со-

тен (см.ниже). Молекулярное генотипирование мутации позволя-

ет проводить прямую пренатальную диагностику соответствующе-

го наследственного заболевания в семьях высокого риска

(см.Главу VII).

Число генов наследственных болезней, локализованных на

каждой хромосоме приведено на Рис. 10.1. В среднем, на каж-

дой из них к 1995г. идентифицировано около 30 таких струк-

турных генов. Обращает на себя внимание неравномерный харак-

тер распределения этих генов. Так, хромосомы 1 и 2 имеют

примерно одинаковые размеры (хромосома 2 даже несколько

крупнее), однако, число уже картированных генов, связанных с

наследственными заболеваниями, на хромосоме 1 в 3 раза мень-

ше, чем на хромосоме 2. Наибольшее число таких генов (больше

100) картировано на Х-хромосоме. Это, по-видимому, можно

объяснить гемизиготным проявлением мутаций генов Х-хромосомы

в компаунде гоносом ХУ у мужчин. Вместе с тем, анализ приве-

денных данных (Рис. 10.1) свидетельствует и о феномене раз-

личной насыщенности разных хромосом структурными генами. На-

ибольшая плотность структурных генов свойственна хромосомам

1, 3, 7, 9, 17, 22, Х. Значительно меньшая - хромосомам 2,

13, 18, 21, У (Antonarakis, 1994). Неслучайно, дисбаланс не-

которых из хромосом 2-й группы часто совместим с постнаталь-

ным развитием (синдром Дауна - трисомия 21; синдром Эдвардса

- трисомия 18; синдром Патау - трисомия 13). По-видимому,

это связано со сравнительно низкой плотностью структурных

генов в этих хромосомах, а также с отсутствием в них генов,

контролирующих ранние стадии развития. Напротив, сравнитель-

но слабая насыщенность известными генами хромосом 2 и 15 в

сочетании с редкостью их дисбаланса даже в абортном материа-

ле, может рассматриваться в пользу наличия в этих хромосомах

"ранних генов", контролирующих начальные стадии онтогенеза

человека: гаметогенез, ранний эмбриогенез. Мутации таких ге-

нов отметаются селекцией уже на этих ранних стадиях, а пото-

му не обнаруживаются постнатально. Стремительный рост даных

о генетической информации, заключенной в каждой хромосоме,

распределении в ней структурных и регуляторных генов, их

взаимодействии с надмолекулярными структурами хромосом (ге-

терохроматином), межхромосомных взаимодействиях и феномене

геномного импринтинга открывает широкие возможности на новом

методическом и концептуальном уровне подойти к проблеме хро-

мосомного (геномного) контроля ранних стадий развития чело-

века - основной проблемы цитогенетики развития млекопитающих

(Баранов, 1984; 1990; 1992; Dyban, Baranov, 1987).

Другое положение, которое следует напомнить в вводной

части этой главы касается специфичности мутационных повреж-

дений каждого структурного гена. Как указывалось ранее

(см.Глава V), несмотря на наличие общих закономерностей в

мутационных процессах, спектр мутаций для каждого гена, рав-

но как и сами структурные гены - уникальны. Причины этой

уникальности кроются в особенностях первичной структуры ДНК

каждого гена, в частности, обогащенности CG нуклеотидами,

его размерах, наличии прямых и обращенных повторов, присутс-

твии внутри гена ДНК последовательностей, гомологичных вне-

генным участкам, что может приводть к нарушениям процессов

рекомбинации в мейозе и.т.д. Для каждого идентифицированного

гена, мутации которого приводят к наследственным заболевани-

ям, разработаны эффективные методы молекулярной диагностики,

как правило, направленные на генотипирование наиболее частых

мутаций этого гена. Реже для этих же целей используется неп-

рямой метод диагностики с помощью молекулярных маркеров

(см.Глава YII).

Цитогенетические карты представляют собой один из спо-

собов однозначной и обьективной систематизации генов. Для

практических целей медико-генетического консультирования и

дифференциальной диагностики моногенных заболеваний подобная

классификация не всегда удобна, так как при составлении карт

генов никак не учитывается информация об особенностях коди-

руемых генами продуктов или о фенотипическом проявлении му-

тантных аллелей. В медицинскихх целях черезвычайно важно

иметь представление о группах генов, кодирующих функциональ-

но и структурно родственные белки, или контролирующие забо-

левания со сходной клинической картиной. Однако, далеко не

всегда классификация по клиническим параметрам может быть

проведена однозначно по ряду причин. Во-первых, большое чис-

ло моногенных наследственных заболеваний носит синдромальный

характер и, зачастую, не удается выделить группу ведущих

клинических симптомов. Во-вторых, многие болезни отличаются

высоким уровнем фенотипической гетерогенности, связанной ли-

бо со спецификой мутационных повреждений, либо с различиями

в окружающих условиях и/или в генетическом фоне (см. Главу

IV). Кроме того, многие болезни, вызванные мутациями в раз-

ных генах, могут протекать сходным образом и, основываясь

только на клинических симптомах, трудно провести дифференци-

альную диагностику подобных заболеваний. Поэтому наиболее

обьективная классификация моногенных наследственных болезней

с известными первичными биохимическими дефектами проводится

на основе классификации соответствующих генопродуктов с уче-

том их участия в определенных метаболических циклах.

В данной заключительной главе мы попытаемся проиллюст-

рировать на ряде примеров теоретические положения, изложен-

ные в предыдущих главах. В качестве примеров будут приведены

краткие молекулярно-генетические характеристики некоторых

классов хорошо изученных и достаточно распространенных моно-

генных наследственных болезней. Большинство из этих завболе-

ваний в той или иной мере изучаются в соответствующих науч-

ных центрах России, а их диагностика в медико-генетических

центрах страны проводится не только по клиническим парамет-

рам, но и с обязательным учетом результатов молекулярного

и/или биохимического обследования.

Раздел 10.2. Метаболические дефекты лизосомных фермен-

тов. Болезни накопления.

В качестве примера наиболее полно и всесторонне изучен-

ных заболеваний мы выбрали группу болезней, обусловленных

наследственными дефектами лизосомальных гидролаз. В Табл.

10.1 представлены данные о наследовании и встречаемости ли-

зосомных болезней, хромосомной локализации и структуре соот-

ветствующих генов, кодируемых ими продуктах и идентифициро-

ванных мутантных аллелях. Даны также ссылки на основные ра-

боты по картированию соответствующих генов, их клонированию

и идентификации мажорных (то есть наиболее частых) мутаций.

Таблица составлена по материалам Каталога наследственных бо-

лезней В. МакКьюсика 1994 г.(McKusik, 1994) и дополнена не-

обходимыми литературными данными.

Таблица 10.1 Молекулярно-генетические основы лизосомных болезней

( N) - примечания, представленные в конце таблицы).

---------------------T--------------T-----------------------T------------------------¬

Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература ¦

МакКьюсику; хромосом-¦белок, размеры¦таций 5), мажорные мута¦(локализация и структура¦

ная локализация; ген ¦в аминокисло- ¦ции -в скобках указаны ¦генов,клонирование кДНК,¦

2);размеры 3); экзоны¦тах 4) ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация мутаций). ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

N-ацетил-альфа-D-га- ¦Очень редко 6)¦Миссенс - 2: ¦Wang et al.,1990 ¦

лактозаминидазы деф.;¦ ¦E325K -Шиндлера болезнь¦Desnick, 1991 ¦

Шиндлера;Канзаки б-нь¦Ацетилгалактоз¦R329W - Канзаки болезнь¦ ¦

104170; 22q11; ¦аминидаза,аль-¦ ¦ ¦

NAGA.2; кДНК-2.2 кб ¦фа-N-; 411¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ангиокератома Фабри; ¦1 : 40 000 ¦Миссенс -31;делеции (от¦ Bishop et al.,1988 ¦

дистопический липидоз¦ ¦1 н. до неск.экз.) -11;¦ Kornreich et al.,1990 ¦

301500; Xq22; ¦Галактозидаза ¦сплайс.-5 (из них 3 с ¦ Davies et al., 1993 ¦

GLA.50; 12 кб, 7 экз.¦альфа; 429¦дел.экз); инс.,дупл.-3 ¦ Eng et al.,1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Аспартилглюкозамину- ¦Более 100 случ¦Миссенс -5; делеции -4;¦Ikonen et al.,1991 ¦

рия, ¦в Финляндии ¦инсерции -2; ¦Ikonen et al.,1992 ¦

208400; 4q23-q27; ¦Аспартилглюкоз¦C163S - мажорная мута- ¦ ¦

AGA.11; ¦аминидаза; 346¦ция в Финляндии (98%) ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Вольмана б-нь;гиперхо¦Более 70 случ.¦Делеция 72 н.,возникшая¦Anderson et al.,1991 ¦

лестерин-гипертригли-¦ ¦в результате сплайсинго¦Anderson et al.,1994 ¦

церидемия, ¦Лизосомальная ¦вой мутации -обнаружена¦Maslen et al,1993 ¦

278000; 10q24-q25; ¦кислая липаза ¦в 2 случаях;миссенс -2;¦Klima et al.,1993 ¦

LIPA.4; 36 кб;10 экз.¦-A ¦инсерция 1 н. - 1. ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Галактосиалидоз, ¦Преим.в Японии¦Делеция экз.7 (сплайс.)¦Galjard et al.,1988 ¦

¦Протективный ¦-мажорная у взрослsх в ¦Wiegant et al.,1991 ¦

256540; 20q13.1; ¦белок бета га-¦Японии; миссенс -6; ¦Takano et al.,1991 ¦

PPGB.7; мРНК - 2 кб ¦лактозидазы452¦F412V - в 2 случаях ¦Zhou et al.,1991 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ганглиозидоз GMI; му-¦Неизвестно ¦Миссенс -10; дуплик.-2;¦Oshima et al.,1988 ¦

кополисахаридоз 1YB, ¦ ¦I51T и R201C-мажорные в¦Noshimoto et al.,1991 ¦

230500; 3p21.33; ¦Галактозидаза ¦в Японии, R482H и W273L¦Suzuki et. al.,1993 ¦

GLB1.12; кДНК - 2кб ¦бета-1; 677¦мажорные в Европе ¦Mosna et al.,1992 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ганглиозидоз GM2-I, ¦1 : 300 000; у¦Миссенс-34;дел.-8;инс.-¦Proia et al.,1987 ¦

варианты B,B1 и псев-¦евреев 1:3 000¦2;сплайс.-8; Мажорные:у¦Myerowitz et al.,1988 ¦

до AB;Тея-Сакса б-знь¦Гексозаминида-¦евреев-инс.4 н.-70%,спл¦Arpaia et al.,1988 ¦

272800; 15q23-q24; ¦за A, альфа ¦айс.-20%;G269S-взр.-20%¦Navon et al.,1989 ¦

HEXA.52; 35 кб, 14экз¦ 529¦не евреи - R247W - 32% ¦Triggs-Raine et al.,1992¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ганглиозидоз GM2, тип¦1 : 300 000 ¦Миссенс -5; делеции -2;¦Proia: 1988 ¦

II,Зандхоффа болезнь,¦ ¦инсерции - 2; Мажорные:¦Neote et al.,1990 ¦

268800; 5q13; ¦Гексозаминида-¦16-кб делеция 1-5 экз.-¦Wakamatusi et al.,1992 ¦

HEXB.9; 40 кб, 14экз.¦за B,бета; 556¦27%;делеция 50кб; P417K¦McInnes et al.,1992 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ганглиозидоз-GM2, AB ¦Очень редко ¦Миссенс -3: C107R; ¦Heng et al.,1993 ¦

вариант, ¦ ¦R169P; C138R (1 пациент¦Schroder et al.,1993 ¦

272750; q31.3-q33.1;¦GM2-активатор-¦гомозиготен) ¦ ¦

GM2A.3; ¦ный белок; 193¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Гоше болезнь; глико- ¦1:600 у евреев¦Миссенс -30;инс.-1;деле¦Sorge et al.,1985 ¦

сфинголипидоз, ¦изол. в Швеции¦ции-3;сплайс.-1; Мажор-¦Sorge et al.,1987 ¦

230800; 1q21; ¦Глюкоцеребро- ¦ные (98%):N370S, L444P,¦Beutler et al.,1992 ¦

GBA.36; ¦зидаза; 644¦R463C,84insG;IVS2+1 G-A¦Horowitz et al.,1994 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Лейкодистрофия глобо-¦1 : 50 000 в ¦Нонсенс мутация:E369TER¦Zlotogora et al.,1990 ¦

ид-клеточная, Краббе,¦Швеции ¦ ¦Sakai et al.,1994 ¦

245200; 14q21-q31; ¦Галактозилцера¦ ¦ ¦

GALC.1; кДНК -3.78 кб¦мидаза 669¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Лейкодистрофия ¦1 : 100 000 ¦Миссенс -7; делеции -2;¦Stein et al.,1989 ¦

метахроматическая, ¦ ¦сплайс. -2; регулят. -1¦Polten et al.,1991 ¦

250100; 22q13.31-qter¦Арилсульфатаза¦Мажорные:P426L и сплайс¦ ¦

ARSA.12; 8 экз¦A 507¦2 -70%, регулят. - 1-2%¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Лейкодистрофия мета- ¦Редко ¦Миссенс -4: T23I,T216I,¦Rorman et al.,1992 ¦

хроматическая, SAP1 ¦ ¦C241S,F385C; ¦Wenger et al.,1989 ¦

деф.; Гоше б-нь, ¦ ¦инсерция 33 н. -1; ¦ ¦

176801; 10q21-q22; ¦Просапозин ¦регуляторная мутация в ¦ ¦

PSAP.6; 20 кб, 13экз.¦ 511¦инициирующем кодоне -1 ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Лизосомальной кислой ¦ ¦ ¦Pohlmann et al.,1988 ¦

фосфатазы деф., ¦Кислая фосфата¦ ¦ ¦

171650; 11p12-p11; ¦за 2, лизосом-¦ ¦ ¦

ACP2.; кДНК-2.1 кб ¦ная 423¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Липидоз сфингомиелино¦Редко ¦Миссенс - 8; делеции -3¦Quintern et al.,1989 ¦

вый;Ниманна-Пика бо- ¦ ¦Мажорные:тип A евреи: ¦Levran et al.,1991 ¦

лезнь,тип A/B, ¦ ¦R496L,L302P,дел.1н.P330¦Schuchman et al.,1992 ¦

257200; 11p15.4-p15.1¦Сфингомиелина-¦в комплексе 65%; тип B ¦Suchi et al.,1992 ¦ ¦

SMPD1.11; ¦за 629¦Сев.Африка R608del->80%¦Takahashi et al.,1992 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ниманна-Пика болезнь,¦Очень редко ¦ ¦Carstea et al.,1993 ¦

тип C, ¦ ¦ ¦Kurimasa et al,1993 ¦

257220; 18p; ¦ ¦ ¦ ¦

NPC.; ¦ ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Ниманна-Пика болезнь,¦Очень редко ¦ ¦Winsor et al.,1978 ¦

тип D, ¦ ¦ ¦ ¦

257250; ¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Маннозидоз, альфа B, ¦50-100 случаев¦ ¦Kaneda et al.,1987 ¦

лизосомальный, ¦Лизосомальная ¦ ¦ ¦

248500; 19p13.2-q12;¦альфа-D-манно-¦ ¦ ¦

MANB.; ¦зидаза B ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Маннозидоз, бета, ¦Очень редко ¦ ¦Lundin,1987 ¦

¦Лизосомальная ¦ ¦ ¦

248510; chr.4?; ¦бета маннози- ¦ ¦ ¦

MANB1.; ¦даза ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

MASA синдром (сложная¦Редко ¦ ¦Schrander-Stumpel ¦

спастическая парапле-¦ ¦ ¦et al.,1990 ¦ ¦

гия), 303350; Xq28; ¦Маннозосвязыва¦ ¦Rosenthal et al.,1992 ¦

MASA.; ¦ющий лектин248¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз 1; ¦1:100 000, ¦Нонсенс -4; миссенс -3;¦Scott et al.,1991 ¦

Гурлера синдром;Шейе,¦1:600 000-Шейе¦сплайс. -1; дел. 1н. -1¦Scott et al.,1992 ¦

252800; 4p16.3; ¦Альфа-L-идуро-¦Мажорные: W402X (31%), ¦Moskowitz et al.,1993 ¦

IDUA.9; 19 кб, 14экз.¦нидаза 653¦Q70X (15%), P533R (3%) ¦Scott et al.,1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз II;¦1:70 000 в Из-¦20% -крупные делеции,из¦Wilson et al.,1990 ¦

Хантера синдром, ¦раиле ¦них 4,5 % -всего гена; ¦Bunge et al.,1993 ¦

309900; Xq28; ¦Идуронат-2- ¦делеции 1-3н-7;миссенс-¦Flomen et al.,1993 ¦

IDS.29; 24 кб, 9 экз.¦сульфатаза 550¦13;нонсенс -4;сплайс.-5¦Hopwood et al.,1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз ¦1 : 24 000 в ¦ ¦Kresse et al.,1971 ¦

IIIA,Санфилиппо синд-¦Нидерландах ¦ ¦ ¦

ром A, 252900; ¦(все типы A-D)¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз ¦Наиболее часто¦ ¦Pande et al.,1992 ¦

IIIB,Санфилиппо синд-¦на юге Европы ¦ ¦ ¦

ром B, 252920;Chr.17?¦ ¦ ¦ ¦

¦ ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Zaremba et al.,1992 ¦

C, Санфилиппо синдром¦ ¦ ¦ ¦

C, 252930;Chr.14 или ¦ ¦ ¦ ¦

21?; ¦ ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз III¦Редко ¦ ¦Robertson et al.,1988a ¦

Санфилиппо синдром D,¦N-ацитил-глюко¦ ¦Robertson et al.,1988b ¦

252940; 12q14; ¦зоамин-6-суль ¦ ¦ ¦

GNS.; ¦фатаза 552¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз IYA¦1 : 300 000 ¦Миссенс - 3: N204K, ¦Tomatsu et al.,1991 ¦

Моркио синдром, ¦ ¦A138V, R386C; ¦Tomatsu et al.,1992 ¦

253000; 16q24.3; ¦Галактозамин-6¦делеция 2 н. - 1 ¦Masuno et al.,1993 ¦

GALNS.4; ¦сульфатаза 522¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз YI;¦Редко ¦Миссенс - 4: C137V, ¦Litjens et al., 1989 ¦

Марото-Лами синдром, ¦ ¦C117R, L236P, C405Y; ¦Schuchman et al.,1990 ¦

253200; 5q11-q13; ¦Арилсульфатаза¦делеция 1н. - 1 ¦Jin et al.,1992 ¦

ARSB.5; ¦B 533¦ ¦Litjens et al., 1992 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Мукополисахаридоз YII¦Очень редко ¦Миссенс - 5: A619V, ¦Guise et al.,1985 ¦

Слая синдром, ¦ ¦R382C, R216W, R354W, ¦Oshima et al., 1987 ¦

253220, 7q21.11; ¦Бета-глюкуро- ¦R611W ¦Miller et al.,1990 ¦

GUSB.5; 21 кб, 12экз.¦нидаза 651¦ ¦Tomatsu et al.,1991 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Сиалидоз типы I и II;¦50-100 случаев¦ ¦Oohira et al.,1986 ¦

липомукополисахаридоз¦ ¦ ¦Klein et al.,1986 ¦

256550; 6p21.3; ¦Нейраминида- ¦ ¦Sasagasako et al.,1993 ¦

NEU.; ¦за-1 ¦ ¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Фукозидоз, ¦30-60 случаев ¦Нонсенс - 5:Q351X-мажор¦Fowler et al.,1986 ¦

¦Фукозидаза аль¦ная (20%), E375X, Q77X,¦Kretz et al.,1992 ¦

230000; 1p34; ¦фа-L-1,ткане- ¦W382X, Y211X;делеции -4¦Roychoudhuri et al.,1988¦

FUCA1.10; 23 кб, 8экз¦вая 461¦(экз2-1,1н-3);сплайс.-1¦Seo et al.,1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+-------------------------

1) - через ";" указаны различные наименования болезней либо

аллельные варианты

2) - после наименования гена через "." указано количество

идентифицированных мутантных аллелей к июлю 1994г.

3) - размеры генов указаны в килобазах (кб), иногда вместо

размеров гена указаны размеры кДНК или мРНК

4) - размеры белка указаны в правом нижнем углу

5) - при количестве мутаций, меньшем 5, все они указываются

после знака ":", при большем количестве перечисляются

только типы мутаций

96) - частоты заимствованы из сводной таблицы Scriver et al., 189.

Сокращения - взр.- взрослые; дел.- делеция; дупл.- дуплика-

ция; инс. - инсерция; н.- нуклеотиды; сплайс. -

замена нуклеотидов в донорном или акцепторном

сайтах сплайсинга или мутации в интронных об-

ластях, создающие новый сайт сплайсинга; экз.-

экзон

Из таблицы 10.1 следует, что для 29 из 31 лизосомных

болезней определена хромосомная локализация гена, причем в

26 случаях - абсолютно однозначно. 23 лизосомных гена клони-

рованы. Для 20 лизосомных заболеваний описаны различные му-

тантные аллели, что подтверждает правильность идентификация

соответствующих генов (см.Главу III). Для 12 заболеваний на-

йены мажорные мутации в различных популяциях. Для 8 заболе-

ваний общее количество идентифицированных мутаций пока не

превысило шести и, возможно, мажорные мутации для них еще

будут идентифицированы.

Спектр мутаций в разных лизосомных генах очень разнооб-

разен. Так, при болезни Фабри наряду с явным преобладанием

миссенс мутаций обнаружено 14 внутригенных перестроек разме-

рами от 0.4 до 8 кб, многие из которых имеют точки разрыва в

экзоне 2 - области локализации большого числа Alu-повторов.

Сам ген GLA содержит 12 различных Alu-элементов, составляю-

щих около 30% его длины. В местах разрывов часто обнаружива-

ются короткие прямые и обращенные 2-6 нуклеотидные повторы.

Одним из возможных механизмов возникновения структурных пе-

рестроек в данном гене может быть незаконная Alu-Alu реком-

бинация или, что более вероятно, рекомбинация между коротки-

ми повторами. Участие Alu-элементов предполагается также при

возникновении 16-кб делеции промоторной области и первых 5-и

экзонов гена HEXB - мажорной мутации при болезни Зандхоффа.

Нарушение процесса рекомбинации является, по-видимому, при-

чиной возникновения очень большого числа крупных и мелких

делеций в IDS-гене при синдроме Хантера. Высокая концентра-

ция CpG динуклеотидов рассматривается как возможный эндоген-

ный механизм возникновения мажорной среди евреев-ашкенази

мутации P330FS в гене SPDM1 при болезни Ниманна-Пика типа B,

так как эта делеция возникает в районе, где из 10 остатков 9

составляют цистеины.

Делеции целых экзонов или инсерции интронных областей

возникают сравнительно часто в результате точковых мутаций в

донорных или акцепторных сайтах сплайсинга. Примерами являют-

ся мажорная в Японии сплайсинговая мутация, сопровождающаяся

делецией 7-го экзона гена- PPGB, приводящая к галактосиалидо-

зу и сплайсинговая мутация IVS2+1, обусловливающая вырезание

экзона 2 гена GBA при болезни Гоше. Появление в результате

точковой мутации в интронной области нового сайта сплайсинга

также может сопровождаться структурными перестройками. Тако-

ва, в частности, природа 33-нуклеотидной инсерции в гене PSAP

при метахроматической лейкодистрофии, обусловленной дефицитом

SAP1; 24-кб инсерции в гене HEXB при болезни Зандхоффа и

5-нуклеотидной инсерции в гене IDUA при синдроме Шейе. Важно

отметить, что подобные мутации совместимы с образованием не-

большого числа функционально активных мРНК, следствием чего

является относительно более мягкое течение соответствующих

форм заболеваний.

В некоторых случаях возникновению мутаций может

способствовать наличие псевдогена. Молекулярный анализ псев-

догена, тесно сцепленного с геном GBA, показал, что, по

крайней мере, 4 мутации, обнаруженные у пациентов с болезнью

Гоше, присутствуют в норме в псевдогене. Это 2 мажорные му-

тации - L444P и IVS2+1 и еще 2 миссенс мутации в 10-м экзоне

(A456P и V460V). Подобное сходство несомненно указывает на

фундаментальную роль псевдогена в образовании мутаций в

GBA-гене. В то же время само по себе присутствие псевдогена

не является мутагенным фактором, особенно если сам ген и его

псевдоген локализованы в разных хромосомах, как, например, в

случае генов GM2A и FUCA1, псевдогены которых находятся в

хромосоме 3 и в области 2q31-q32, соответственно.

Для двух лизосомных болезней - фукозидоза и синдрома

Гурлера, мажорными являются нонсенс мутации. Более того, при

фукосидозе все известные к настоящему времени мутации приво-

дят к полному отсутствию продукта FUCA1-гена. Так, наряду с

мажорной мутацией Q351X, представленной в 20% хромосом у

больных фукосидозом, описаны еще 4 нонсенс мутации и 4 деле-

ции со сдвигом рамки считывания. При синдроме Гурлера две

мажорные нонсенс мутации - W402X и Q70X, составляют около

50% всех известных мутантных аллелей гена IDUA. Кроме того,

при этом заболевании зарегистрированы еще 4 минорные по

частоте нонсенс мутации и 1 делеция со сдвигом рамки считы-

вания. 3 миссенс мутации и интронная мутация, создающая до-

полнителный сайт сплайсинга в гене IDUA, не приводят к пол-

ному блоку синтеза идуронидазы и реализуются в виде синдрома

Шейе. Уместно заметить, что оба заболевания - синдром Гурле-

ра и синдром Шейе, являются классическим примером фенотипи-

ческого разнообразия, обусловленного существованием аллель-

ных серий (см.Главу IV). Такой спектр крайне тяжелых мутаций

нельзя объяснить только повышенной частотой их возникнове-

ния. Более вероятным представляется предположение о том, что

кодируемые FUCA1- и IDUA-генами белки обнаруживают опреде-

ленную устойчивость к небольшим повреждениям и сохраняют

функциональную активность при определенных аминокислотных

заменах, то есть миссенс аллели в этих генах проявляют себя

как нейтральные мутации и не приводят к развитию заболева-

ний.

Хорошо известно, что распространение мутаций в популя-

циях определяется не только, и не столько повышенной часто-

той их возникновения, но многими другими популяционно-гене-

тическими факторами и, в первую очередь, связано с эффектом

основателя (см.Главу V). Типичным следствием эффекта основа-

теля, как известно, является наличие различных мажорных по

частоте мутаций одного и того же гена у пациентов разных

изолятов и этнических групп. Подобная картина наблюдается, в

частности, при ганглиозидозе GMI. Так, в Японии мажорными

при этом заболевании являются миссенс мутации I51T и R201C,

тогда как в Европе преобладают мутации R482H и W273L. Эффек-

том основателя можно объяснить высокую частоту аспартилглю-

козаминурии в Финляндии, так как в 98% случаев у пациентов

финского происхождения заболевание обусловлено присутствием

одной и той же миссенс мутации C163S, резко уменьшающей ак-

тивность аспартилглюкозаминидазы. Интересно отметить, что

эта мутация у больных находится в сильном неравновесном

сцеплении с другой миссенс мутацией в AGA-гене - R161Q, яв-

ляющейся, в свою очередь, редкой формой полиморфизма. Невоз-

можно, однако, исключить возможность комбинированного влия-

ния этих двух мутаций на фенотип.

Яркие примеры этнических различий по частоте и спектру

мажорных мутаций выявляются при анализе таких лизосомных бо-

лезней накопления как болезнь Тея-Сакса, Ниманна-Пика и бо-

лезнь Гоше. Прежде всего, эти заболевания особенно распрост-

ранены среди евреев-ашкенази, среди которых они встречаются

в десятки раз чаще, чем в других популяциях европейского или

азиатского происхождения. Наличие специфических мажорных му-

таций для всех трех заболеваний у 70 - 95% всех пациентов

еврейского происхождения скорее всего нельзя обьяснить толь-

ко эффектом основателя. Генетический дрейф, селективное пре-

имущество гетерозигот, характер миграции, социальные и рели-

гиозные особенности, обусловливающие ассортативность образо-

вания супружеских пар - вот те факторы, которые, по всей ви-

димости, лежат в основе этих различий. В этой связи инте-

ресно отметить, что среди пациентов других национальностей

мажорные мутации гомологичных генов, как правило, иные, чем

у евреев-ашкенази. Так, болезнь Ниманна-Пика типа B часто

встречается среди жителей стран, расположенных в западной

части Северной Африки. Однако, в 80% случаев заболевание

связано с делецией R608 в SMPD1-гене, которая не является

мажорной среди евреев-ашкенази.

На примере лизосомных болезней могут быть хорошо

прослежены корреляции между типами мутаций и клиническими

особенностями заболеваний. Выше уже упоминалось об аллельных

вариантах гена IDUA, приводящих либо к синдрому Гурлера, ли-

бо к синдрому Шейе. Разные миссенс мутации в гене NAGA при-

водят к болезни Шиндлера или к болезни Канзаки (Табл.

10.1.). Важное значение для анализа молекулярных основ пато-

генеза заболеваний имеют специфические мутации с поздней фе-

нотипической манифестацией (так называемые взрослые формы).

Такие мутации обнаружены в соответствующих генах при болез-

нях Тея-Сакса и галактосиалидозе. Очень интересен случай

различного фенотипического проявления на разном расовом ге-

нетческом фоне одной и той же мутации - мажорной 16-кб деле-

ции, обнаруживаемой у 27% пациентов с детской формой болезни

Зандхоффа (McInnes et al.,1992; Sidransky et al.,1994). В

частности, в одной франко-канадской семье эта мутация в ком-

паунде с миссенс мутацией P417L, описанной впервые в Японии

у пациента с подростковой формой заболевания, провлялась как

взрослая форма с очень мягким течением заболевания.

В ряде случаев удалось проанализировать молекулярную

природу совместного влияния двух аллелей одного гена на фе-

нотип. К примеру, при некоторых форм метахроматической лей-

кодистрофии трудность молекулярной диагностики заболевания

связана с существованем, так называемого, псевдодефицитного

аллеля ARSA-гена. Этот полиморфный аллель встречается в по-

пуляциях с достаточно высокой частотой, так что гомозиготы

по нему состаляют 1 - 2% всего населения. Оказалось, что

псевдодефицитный аллель представляет из себя сочетание двух

мутаций в цис-положении. Одна из них - 3'-концевая ругуля-

торная мутация в первом сайте после стоп кодона, изменяет

сигнал полиаденилирования. Другая - миссенс мутация в 6-м

экзоне, приводит к потере сайта N-гликозилирования. Попутно

отметим, что для гена ARSA (также как и для IDUA-гена) обна-

ружен альтернативный сплайсинг, в результате которого в фиб-

робластах и печени образуются 2 различных типа мРНК, разме-

ром 2.1 кб и 3.9 кб, соответственно. У гомозигот по псевдо-

дефицитному аллелю в фибробластах отсутствует 2.1 кб мРНК,

при этом клинических проявлений заболеваний не наблюдается.

Однако, при наличии S96F мутации в ARSA-гене на фоне псевдо-

дефицитного аллеля развивается тяжелая форма лейкодистрофии.

В заключении раздела кратко рассмотрим состояние проб-

лемы генокоррекции лизосомных заболеваний. В литературе

отсутствуют сообщения об успешных клинических испытаниях

программ генотерапевтического лечения этих заболеваний, од-

нако, по крайней мере, для некоторых лизосомных болезней та-

кие программы уже разработаны и утверждены (см.Главу IX,

Табл.9.2). Имеются сведения о положительных результатах та-

ких исследований на культурах мутантных клеток и на модель-

ных животных. Так, в опытах in vitro был осуществлен успеш-

ный ретровирусный перенос нормальной кДНК гена GBA в культу-

рах мутантных фибробластов (Sorge et al.,1987) и в культурах

клеток крови пациентов с болезнью Гоше (Fink et al., 1990),

в результате чего была достигнута коррекция глюкоцеребрози-

дазной активности. Такая же коррекция метаболическоих дефек-

тов при болезни Ниманна-Пика и при синдроме Хантера была

достигнута путем введения в соответствующие мутантные линии

клеток нормальных кДНК генов SMPD1 и IDS соответственно. При

этом активность идуронат-2-сульфатазы после ретровирусной

трансдукции in vitro оказалась существенно выше нормальной и

рекомбинантный фермент активно участвовал в метаболизме глю-

козамногликанов. Генокоррекция первичного биохимического де-

фекта при мукополисахаридозе YII (синдром Слая) была получе-

на как in vitro, путем ретровирусного переноса нормального

гена GUSB в мутантные фибробласты человека, так и in vivo на

собаках и мышах. При этом у больных собак нормальный белок

(бета-глюкуронидаза) не только экспрессировался, но появ-

лялся в лизосомах и восстанавливал процессинг специфических

глюкозоаминогликанов (Wolf et al., 1990). Введение этого же

гена (GUSB) в мутантные стволовые клетки мышей приводило к

длительной экспрессии бета-глюкуронидазы, снижению лизосо-

мального накопления в печени и мозге и частичной коррекции

болезни у трансгенных животных (Wolf et al.,1992). В другом

эксперименте GUBS-кДНК вводили в культивируемые мутантные

фибробласты кожи мышей и затем трансдуцированные клетки имп-

лантировали подкожно мутантным мышам. У всех животных наблю-

дали экспрессию введенного гена и полное исчезновение ли-

зосомальных отложений в печени и в мозге (Sly, 1993). Полу-

ченные результаты подтверждают принципиальную возможность

лечения, по крайней мере, некоторых лизосомных болезней с

помощью методов генной терапии.

Раздел 10.3. Болезни экспансии, вызванные "динамически-

ми" мутациями.

Обнаруженный в 1991г. новый тип так называемых динами-

ческих мутаций и связанные с ними наследственные заболевания

частично рассматривались нами в Главе IV. Однако их уникаль-

ность, необычный механизм экспрессии, особенности наследова-

ния, быстрый рост нозологий, обусловленных подобными наруше-

ниями в последовательности ДНК, и, как оказалось, достаточно

широкая распространенность (см.Табл.9.2) делают целесообраз-

ным их более подробный анализ.

Как упоминалось, этот тип мутаций пока найден только у

человека и не зарегистрирован ни у одного вида млекопитающих

или других хорошо изученных организмов (дрозофила, нематоды

и пр.). Суть мутаций заключается в нарастании числа триплет-

ных повторов, расположенных в регуляторной или в кодирующей,

а значит и в транслируемой части генов. Впервые такой тип

мутации был обнаружен при молекулярном анализе синдрома фра-

гильной (ломкой) Х-хромосомы, наследственная передача кото-

рой не подчинялась обычным менделевским законам. В дальней-

шем аналогочные динамические мутации были описаны и при 7

других наследственных заболеваниях, контролируемых генами,

расположенными на разных хромосомах - Таблица 10.2. Вместе с

тем, все нижеперечисленные нозологии имеют ряд общих призна-

ков, позволяющих объеденить их в одну самостоятельную груп-

пу. Прежде всего, для триплетных повторов, экспансия которых

блокирует функцию гена, характерен выраженный популяционный

полиморфизм, причем число аллелей может варьировать от еди-

ниц до нескольких десятков. Другой их особенностью является

доминантный тип наследования, характерный как для Х-сцеплен-

ных генов, так и для генов, находящихся на аутосомах. Осо-

бенностью практически всех болезней "экспансии" является

также эффект антиципации (ожидания), смысл которого заключа-

ется в нарастании тяжести симптомов заболевания в последую-

щих поколениях, что, как оказалось, является результатом на-

копления ("экспансии") исходного числа триплетов после того

как их количество возрстает больше нормального. Характерными

для этих нозологий являются и особенности их передачи по-

томству: для некоторых заболеваний типична передача по мате-

ринской (Fra-X, миотоническая дистрофия), а для других -

преимущественно по отцовской линии (хорея Гентингтона).

Практически для всех "динамических" мутаций характерно пора-

жение головного мозга и особенно подкорковых структур, при-

чем тяжесть заболевания и его начало четко коррелируют с

числом повторов. Молекулярный анализ этих генов позволяет

предполагать определенное сходство механизма экспансии трип-

летов, которая, по всей вероятности, происходит в митозе,

затрагивает чаще аллели с начально большим числом повторов,

при этом нередко сигналом экспансии является утрата негомо-

логичного триплета, в норме разделяюего цепочку монотонных

повторов. Вместе с тем, патогенетические механизмы проявле-

ния мутаций экспансии принципиально различны. В случае раз-

личных вариантов FRAX мутаций наблюдается блок экспрессии

соответствующих генов вследствие стабильного метилирования

области CpG островка в промоторной части генов. При миотони-

ческой дистрофии нарушение экспрессии, по-видимому связано с

ошибками взаимодествия транскрибируемой нити ДНК с нуклеосо-

мами. В случае остальных сугубо нейродегенеративных заболе-

ваний (хорея Гентингтона, спинально-бульбарная мышечная ат-

рофия и др.) экспрессия гена не нарушена, однако, образую-

щийся белковый продукт с необычно длинной полиглутаминовой

цепочкой каким-то образом нарушает процессы нормального ме-

таболизма нервных клеток подкорковых отделов мозга.

Таким образом, причиной повреждающего действия одних

"динамических" мутаций является блок генной экспрессии, то

есть потеря функции (loss-of-function mutation), тогда как

другие мутации того же типа, связанные с нейродегенративными

заболеваниями, ведут к появлению белковых продуктов с ано-

мальными функциями ( мутации типа -gain-of-function). Инте-

ресно отметить, что помимо динамических мутаций для каждого

названного гена обнаружены единичные точковые мутации, число

которых крайне невелико. Для каждой болезни "экспансии" раз-

работан свой вариант диагностики, основанный на ПЦР. Ампли-

фикация области триплетных повторов и дальнейший электрофо-

ретический анализ синтезированных продуктов позволяет опре-

делить число повторов, то есть провести генотипирование ал-

лелей. Вместе с тем, при числе повторов более 200, амплифи-

кация с помощью ПЦР обычно не достигается. В этих случаях

размеры участка повторов определяются методом блот-гибриди-

зации с соответствующими ДНК зондами. Например, используются

зонды StB12.3, Ох1.9 или Ох 0.55 в случае синдрома FRAXA;

зонд cDNA25 в случае миотонической дистрофии.

Подробней с этой интересной группой заболеваний можно

ознакомиться в ряде обзоров (Willems, 1994; Баранов и

др.,1993; Иллариошкин и др., 1995).

Таблица 10.2. Болезни экспансии, вызванные динамическими му-

тациями.

-----------------------T-----------T-------T-----T------T------T----------------------¬

Болезнь, номер по ¦ Ген, лока-¦Триплет¦Норма¦Прему-¦Мута- ¦Литература ¦

МакКьюсику (MIM) ¦ лизация ¦ ¦ ¦тация ¦ция ¦ ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Синдром ломкой X-хро- ¦FMR1, FRAXA¦(CGG)n ¦5-50 ¦50-90 ¦>90 ¦Rousseau et al.,1991 ¦

мосомы; 309550¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Hirst et al.,1991 ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Синдром ломкой X-хро- ¦FMR2, FRAXE¦(CGG)n ¦6-25 ¦25-200¦>200 ¦Knight et al.,1994 ¦

мосомы тип 2; 309548¦Xq27.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Миотоническая дистро- ¦DM, MP-1 ¦(CTG)n ¦5-10 ¦19-30 ¦>30 ¦Shelbourne et al.,1992¦

фия; 160900¦19q13.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Wieringa,1994 ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Хорея Гентингтона; ¦HD, IT-15 ¦(CAG)n ¦6-37 ¦ ¦37-121¦Huntington's Dis. ¦

143100¦4p16.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Collab.Res.Group,1993 ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Спинально-мозжечковая ¦SCA1 ¦(CAG)n ¦6-39 ¦ ¦41-81 ¦Orr et al.,1993 ¦

атаксия тип 1; 164400¦6p21.3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Chung et al.,1993 ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Денто-рубральная-палли-¦DRPLA, B-37¦(CAG)n ¦7-34 ¦ ¦54-75 ¦ Koide et al.,1994 ¦

до-люисовая дегенерация¦12pter-p12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Nagafuchi et al.,1994¦

125370¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Спинально-бульбарная ¦AR ¦(CAG)n ¦12-33¦ ¦40-62 ¦La Spada et al.,1991 ¦

мышечная атрофия;313200¦Xq11-q12 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+----------------------+

Спинально-мозжечковая ¦MJD ¦(CAG)n ¦13-36¦ ¦68-79 ¦Kawaguchi et al.,1994 ¦

дегенерация Мачадо- ¦14q32.1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

Джозефа ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦

-----------------------+-----------+-------+-----+------+------+-----------------------

Раздел 10.4. Моногенные наследственные болезни, диаг-

ностируемые молекулярными методами в России.

Сводка, представленная в таблице 10.3, составлена на

основании анализа работ основных отечественных лабораторий и

публикаций, связанных с проблемой молекулярной диагностики

наследственных болезней. Сводка не является исчерпывающей и

включает преимущественно те заболевания для которых возможна

или уже проводится диагностика на внутриутробных стадиях

развития (Баранов, 1994).

Таблица 10.3. Моногенные наследственные болезни, диагности-

руемые молекулярными методами и доступные пренатальной диаг-

ностике в России.

-----T-----------------------------------T------------------¬

¦N пп¦ Болезни ¦Медицинские центры¦

+----+-----------------------------------+------------------+

¦1 ¦ Муковисцидоз ¦ИАГ;ИЭМ РЦМГ; ТИМГ¦

¦2 ¦ Миодистрофия Дюшенна/Беккера ¦ИАГ;РЦМГ; ТИМГ ¦

¦3 ¦ Гемофилия А ¦ИАГ; ГНЦ; ¦

¦4 ¦ Гемофилия В ¦ИАГ; ГНЦ ¦

¦5 ¦ Фенилкетонурия ¦ИАГ; ГНЦ;ПМА;РЦМГ ¦

¦6 ¦ Синдром ломкой Х-хромосомы ¦ИАГ; ¦

¦7 ¦ Миотоническая дистрофия ¦ИАГ ¦

¦8 ¦ Болезнь Виллебранда ¦ИАГ;ГНЦ ¦

¦9 ¦ Хорея Гентингтона ¦ИАГ; РЦМГ; НИИН ¦

¦10 ¦ Болезнь Леш-Нихана ¦ИАГ ¦

¦11 ¦ Спинально-бульбарная мышечная ¦ИАГ; НИИН ¦

¦ ¦ атрофия ¦ ¦

¦12 ¦ Гепато-лентикулярная дегенерация ¦РЦМГ; ИАГ ¦

¦13 ¦ Болезнь Хантера ¦ИАГ ¦

¦14 ¦ Адрено-генитальный синдром ¦ЦОЗМиР; РЦМГ ¦

¦15 ¦ Атаксия Фридрейха ¦ГНЦ ¦

¦16 ¦ в- Талассемия ¦ГНЦ; ПМА ¦

¦17 ¦ Болезнь Верднига-Гоффмана ¦РЦМГ ¦

¦18 ¦ Дефицит альфа-1-антитрипсина ¦ИЭМ ¦

¦19 ¦ Семейная гиперхолестеринемия ¦ИЭМ; ПМА ¦

¦20 ¦ Предрасположенность к инсулин- ¦ПМА ¦

¦ ¦ зависимому диабету ¦ ¦

¦21 ¦ Дефицит ацил-СоА дегидрогеназы ¦ПМА ¦

L----+-----------------------------------+-------------------

ИАГ - Институт Акушерства и Гинекологии РАМН, Санкт Петербург

ИЭМ - Институт Экспериментальной Медицины РАМН, Санкт Петербург

ПМА - Педиатрическая Медицинская Академия, Санкт Петербург

РЦМГ- Российский Центр Медцинской Генетики РАМН, Москва

ГНЦ - Гематалогический Научный Центр МЗ РФ, Москва

ТИМГ- Томский Институт Медицинской Генетики, Томск

НИИН- Научно-исследовательский Институт Неврологии РАМН, Москва

ЦОЗМиР- Центр Охраны Здоровья Матери и Ребенка, Москва

Молекулярные характеристики некоторых из приведенных в

таблице заболеваний уже были рассмотрены в разделах 10.1 и

10.2. Отдельные аспекты, касающиеся идентификации соот-

ветстующих генов, их картирования, клонирования и сканирова-

ния мутаций уже упоминались в качестве примеров при изложе-

нии соответствующих вводных глав монографии (см.Главы II,

III, IV, V). В этой части нам представляется целесообразным

суммировать эти разрозненные сведения и охарактеризовать те

наиболее частые, социально значимые моногенные заболевания,

в отношении которых у нас накоплен достаточно большой

собственный опыт молекулярных исследований. Список этих но-

зологий, их частоты и основные молекулярные характеристики

приведены в Таблице 10.4.

Таблица 10.4. Основные молекулярно-генетические характе-

ристики моногенных болезней, диагностируемых

в Лаборатории пренатальной диагностики ИАГ

РАМН, Санкт-Петербург.

(примечания в конце таблицы те же, что в Табл.10.1).

---------------------T--------------T-----------------------T------------------------¬

Синдромы 1), номер по¦Встречаемость,¦Типы и количество му- ¦Литература ¦

МакКьюсику; хромосом-¦белок, ¦таций 4), мажорные мута¦(локализация и структура¦

ная локализация; ген ¦размеры в ами-¦ции -в скобках указаны ¦генов,клонирование кДНК,¦

2),размеры 3), экзоны¦нокислотах ¦частоты аллелей у б-ных¦идентификация мутаций). ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Муковисцидоз; врожден¦1:2500- Европа¦Точковые-преобладающие;¦Rommens et al., 1989 ¦

ное отсутствие vas de¦1:3800 -Россия¦небольшие дел.и дупл.; ¦Kerem et al., 1989 ¦

ferens, ¦CF-трансмемб- ¦Мажорные:delF508-30-90%¦Riordan et al., 1989 ¦

219700; 7q31.2 ¦ранный регуля-¦W1272X-2-33%,3732delA -¦Горбунова и др., 1991 ¦

CFTR.500; 260кб,27экз¦тор 1480¦4%,394delTT,G542X,R117H¦Баранов и др., 1995 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Миопатия Дюшенна; Бек¦1:3500 мальчи-¦Делеции протяженные - ¦Kunkel et al.,1985 ¦

кера;кардиомиопатия ¦ков ¦60%; дупликации - 6-7%;¦Kunkel et al.,1986 ¦

делеционная, ¦ ¦делеции нескольких н. -¦Koenig et al.,1988 ¦

310200; Xp21.2 ¦Дистрофин ¦7; нонсенс - 9; сплайс.¦Roberts et al.,1992a;b ¦

DMD.21; 2000кб,73экз ¦ 3685¦-3; миссенс -1; инс.-1 ¦Ahn et al.,1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Гемофилия А, ¦1:6500 мальч. ¦Делеции экз. - 31; мис-¦Wood et al, 1984 ¦

фактора YIII деф.; ¦Фактор YIII ¦сенс - 21; нонсенс -8 ¦Toole et al., 1984 ¦

306700; Xq28 ¦свертываемости¦Мажорные: инверсия 26 -¦Higuchi et al.,1991 ¦

F8C.66; 186 кб, 26экз¦крови 2351¦25 экзонов - 45% семей ¦Naylor et al., 1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Гемофилия B, Кристма-¦1:20000 мальч.¦Миссенс и нонсенс более¦Kurachi et al., 1982 ¦

са, фактора IX деф.; ¦Фактор IX ¦60%; сплайс.-10%; регу-¦Jagadeeswaran et al,1984¦

306900, Xq27.1-q27.2 ¦свертываемости¦лят.- 3.5%; делеции -до¦Green et al., 1991 ¦

F9.400; 34 кб, 8 экз ¦крови 461¦40% при тяжелых формах ¦Giannelli et al., 1993 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

фон Виллебранда бо- ¦1: 5 - 20 000 ¦Тип I и II-миссенс; Ма-¦Lynch et al., 1985 ¦

лезнь, ¦Фактор Y111R ¦жорные:R543W,R545C,V553¦Bonthorn et al., 1986 ¦

193400; 12pter-p12 ¦свертываемости¦M,R578Q.Тип III-делеции¦Cooney et al., 1991 ¦

F8VWF.22; 178кб,52экз¦крови ¦1 н.в 28экз; нонсенс -4¦Randi et al., 1991 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Фенилкетонурия; гипер¦1 : 10 -15 000¦Миссенс -62%; нонсенс -¦Guttler, Woo, 1986 ¦

фенилаланинемия, мяг-¦Фенилаланин- ¦13%;сплайс.-13%;делеций¦DiLella et al., 1986 ¦

кая, 261600; 12q24.1¦гидроксилаза ¦9%; Мажорные: IVS12+1, ¦Cotton, 1990 ¦

PAH.70; 90 кб, 13 экз¦ 452¦R408W,R261Q,R158Q,IVS10¦Барановская и др. 1995 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Леш-Нихана синдром; ¦ ¦Миссенс -53%;небольшие ¦Jolly et al., 1983 ¦

HPRT-родств. подагра,¦Гипоксантин- ¦структ.перестройки -40%¦Edwards et al., 1990 ¦

308000; Xq26-q27.2 ¦фосфорибозил ¦сплайс. -5%; нонсенс-2%¦Rossiter et al., 1991 ¦

HPRT.100; 44 кб,9 экз¦трансфераза217¦Мажорные: R170TER (15%)¦Sculley et al., 1992 ¦

---------------------+--------------+-----------------------+------------------------+

Гепато-лентикулярная ¦ ¦Миссенс -15; делеции/ ¦Bull et al., 1993 ¦

дегенерация Вильсона-¦ ¦инсерция -14;Мажорные -¦Petruchin et al., 1993 ¦

Коновалова, ¦Медь-транспор-¦H714Q - 31% в Америке, ¦Tanzi et al., 1993 ¦

277900; 13q14.3-q21.1¦тирующая АТФа ¦22% в России; 1 н. дел.¦Thomas et al., 1995 ¦

ATP7B.34; ¦за P типа 1434¦H1070Gl-28%;Gl1267L 10%¦ ¦

---------------------+--------------+-----------------------+-------------------------

Многим из приведенных в Табл.9.4 заболеваний посвящены

обстоятельные обзоры, руководства и монографии, включающие

наряду с клиническими данными специальные разделы, посвящен-

ные молекулярной природе патологического процесса, характе-

ристике гена, его мутаций, их фенотипических проявлений, а

так же последним достижениям и перспективам лечения, включая

генную терапию. Некоторые из этих публикаций уже были упомя-

нуты в предыдущих разделах книги, другие будут процитированы

в соответствующих подразделах этой главы. Следует так же

упомянуть, что все приведенные нозологии были первыми моно-

генными болезнями, которые были исследованы молекулярными

методами в нашей стране и для которых, в итоге , были разра-

ботаны и оптимизированы с учетом этнических и национальных

особенностей аллельного полиморфизма, частот и паттерна му-

таций оптимальные схемы молекулярной обследования семей

высокого риска с целью пренатальной диагностики и выявления

гетерозиготного носительства. Практически все эти исследова-

ния проводились в рамках основных научных программ ГКНТ "Ге-

ном Человека" и "Приоритетные направления генетики". Обзор

отечественных работ по молекулярной диагностике наследствен-

ных болезней представлен в ряде научных сводок (Баранов,

1992; 1994; Baranov, 1993; Баранов и др., 1994; Евграфов,

1993).

10.4.1 Муковисцидоз.

Муковисцидоз (кистозный фиброз поджелудочной железы) -

самое распространенное моногенное наследственное заболевание

у представителей белой расы. Это первая "генная" болезнь,

молекулярные основы которой определены методами позиционного

клонирования без использования каких-либо данных о структур-

ных перестройках в области локализации предполагаемого гена.

Напомним, что обнаружение пациентов с транслокациями или

крупными делециями, затрагивающими исследуемый ген, значи-

тельно облегчает его картирование и идентификацию, как это

было при миопатии Дюшенна, ретинобластоме или хроническом

грануломатозе. В области локализации гена муковисцидоза хро-

мосомные перестройки, практически, отсутствуют. Подробно об

истории открытия гена, его структуре, клонировании, анализе

функций, идентификации мутаций можно ознакомиться в следую-

щих отечественных работах (Гембицкая, Баранов, 1991; Бара-

нов, Гинтер, 1994).

Белковый продукт гена -трансмембранный регуляторный бе-

лок муковисцидоза -ТРБМ (cystic fibrosis transmembrane

regulator -CFTR), как оказалось, является белком хлорных ка-

налов, регулирующих обмен ионов хлора через апикальные мемб-

раны всех эпителиальных клеток организма. В зависимости от

типа мутаций, их локализации функция гена ТРБМ при муко-

висцидозе может быть полностью или частично нарушенной.

К началу 1995г. в гене ТРБМ идентифицировано более 500

мутаций, несколько делеций и дупликаций. Наболее распростра-

ненной у жителей Западной Европы и Северной Америки является

мутация delF508, приводящая к отстутсвию фенилаланина в 508

положении белка ЕРМБ. В этих странах частота delF508 нахо-

дится в пределах 70-85%. В Европе частота мутации обнаружи-

вает определенный градиент распространения с севера на юг и

с запада на восток, достигая 85% в Дании она уменьшается до

50% в Италии и до 20-30% в Турции. В Европейской части

России она составляет около 50% всех мутантных (CF) хро-

мосом. У евреев-ашкенази доминируюшей по частоте является

мутация W1282X (33%).

Биохимический анализ клеток пациентов, больных муко-

висцидозом, позволил выяснить фенотипические особенности

экспрессии мутантных аллелей гена ТРБМ, установить опреде-

ленный градиент патологических нарушений на мембранном, кле-

точном и организменном уровнях в зависимости от типа мута-

ции, её локализации и структуры аномального белкового про-

дукта (Баранов, Гинтер,1994). Так, было установлено, что не-

которые CFTR- мутации, в том числе и delF508, не препятствуя

трансляции, нарушают процессинг белка так, что он не дости-

гает апикальной мембраны и не создает хлорный поток. Этим

объясняется тяжелая клиника муковисцидоза при подобных нару-

содержание .. 349 350 351 ..