Государственная фармакопея СССР - часть 8

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИНСУЛИНА

       Активность испытуемого  препарата  инсулина  определяют  путем

   сопоставления  его гипогликемического (сахаропонижающего) действия

   с гипогликемическим действием стандартного образца инсулина.

            Стандартный образец и единица действия инсулина

       Стандартный образец  инсулина  представляет   собой   препарат

   высокоочищенного  инсулина,  активность  которого определена путем

   многократного сопоставления с активностью международного стандарта

   и  составляет  не  менее  25  ЕД в 1 мг.  За единицу действия (ЕД)

   принимают специфическую активность количества  массы  стандартного

   образца, эквивалентного по биологическому действию 1 международной

   единице инсулина.

       Примечание. Приготовление  растворов  стандартного  образца  и

   испытуемого   препарата   инсулина.  Точную  навеску  стандартного

   образца инсулина растворяют в растворе хлористоводородной  кислоты

   (0,003  моль/л)  с  рН  2,7-3,0,  содержащем консервант в такой же

   концентрации, как испытуемый препарат.

       Срок годности основного раствора стандартного образца инсулина

   4 мес при температуре 4 град. С.

       Перед опытом основной раствор  стандартного  образца  инсулина

   разводят  раствором  хлористоводородной  кислоты (0,003 моль/л) до

   концентрации 1 ЕД в 1 мл.  Испытуемый препарат  инсулина  разводят

   этим  же раствором хлористоводородной кислоты до концентрации 1 ЕД

   в 1 мл, исходя из его предполагаемой активности.

               Метод определения биологической активности

       Определение биологической  активности  инсулина  проводят   на

   здоровых  кроликах  массой 2,5-3,5 кг.  Животных массой 1,8-2,3 кг

   предварительно не менее 14 сут содержат в  условиях  вивария,  где

   они   получают   овес,   сено   или   свежую   траву,  корнеплоды,

   комбинированный корм и воду.  По истечении этого срока  определяют

   чувствительность кроликов к инсулину.  Для этого кроликам дважды с

   интервалом 7-8 сут после 18 ч голодания  вводят  подкожно  раствор

   стандартного образца инсулина из расчета 0,5 ЕД на 1 кг массы тела

   животного и определяют величину  снижения  концентрации  сахара  в

   крови  в  процентах.  Кровь для исследования берут из краевой вены

   уха животных до введения инсулина и через 1,5 и 2,5  ч  после  его

   введения (для расчета берут среднюю концентрацию сахара в крови из

   двух определений после введения инсулина). Кровь берут в условиях,

   не допускающих чрезмерного волнения кроликов.  Из опытов исключают

   животных с исходной концентрацией  сахара  в  крови  ниже  и  выше

   пределов,   установленных  для  используемого  метода  определения

   содержания сахара в крови (ниже 75 мг %  и  выше  120  мг %    для

   феррицианидного метода,   ниже  52  мг  %  и  выше  94  мг %   для

   глюкозооксидазного  метода),  а  также   тех   животных,   которые

   реагируют  на  введение инсулина судорогами или у которых снижение

   концентрации сахара в крови составляет менее 15%  по  отношению  к

   исходной   концентрации.   Определение   биологической  активности

   инсулина проводят не ранее чем через 7-8 сут  после  испытания  на

   чувствительность.

       Отобранных для опытов кроликов лишают корма (но не воды) на 18

   ч,  предшествующих введению инсулина. Животных распределяют на две

   группы способом случайного выбора (в каждой группе должно быть  не

   менее   9  кроликов).  Непосредственно  перед  введением  инсулина

   кроликов взвешивают,  и определяют исходную концентрацию сахара  в

   крови.   Кроликам   одной   группы   вводят  подкожно  по  0,5  ЕД

   стандартного образца инсулина (S) на 1  кг  массы  тела,  кроликам

   другой  группы - такую же дозу испытуемого препарата инсулина (Т).

   Через 1,5 и  2,5  ч  после  введения  инсулина  у  животных  снова

   определяют концентрацию сахара в крови.

       Для каждого кролика рассчитывают снижение концентрации  сахара

   (X) в крови в процентах по формуле:

                               а - b

                          Х = -------  х 100,

                                 а

   где а  -  исходная  концентрация  сахара  в  крови  в миллиграмм -

   процентах;  b - средняя концентрация сахара в крови в миллиграмм -

   процентах из двух определений, проведенных через 1,5 и 2,5 ч после

   введения инсулина.

       Как и  при  испытании кроликов на чувствительность к инсулину,

   при расчетах не учитывают животных с исходной концентрацией сахара

   в  крови  ниже  и  выше пределов,  установленных для используемого

   метода,  а также реагирующих на указанную дозу инсулина судорогами

   или  дающих  снижение  концентрации  сахара в крови менее  15%  по

   отношению к исходной концентрации.

       Через 3-5 сут на этих же кроликах проводят повторное испытание

   с той разницей,  что животным из  группы,  получавшей  стандартный

   образец инсулина (S),  вводят испытуемый препарат инсулина (Т),  а

   животным группы, получавшей (Т), вводят (S).

       Рассчитывают среднюю  величину  снижения концентрации сахара в

   крови на стандартный образец (%S) и на испытуемый препарат (%Т) по

   данным всего  опыта.   Отношение   %T / %S  выражает относительную

   активность (R) испытуемого препарата (Т). Для выражения активности

   испытуемого  препарата  (Т) в ЕД его предполагаемую активность (А)

   умножают на R: Т = R х A.

       Пример: при  определении биологической активности инсулина для

   инъекций с предполагаемой  активностью  40  ЕД  в  1  мл  получили

   следующие   величины   снижения  концентрации  сахара  в  крови  в

   процентах (Y).

        Первая часть испытания           Вторая часть испытания

            Ys        Yт                       Yт         Ys

            49        48                       50         50

            61        50                       58         51

            35        48,5                     53         41

            55        65                       55         55

            39        46                       39         45

            28        22,5                     68         60

            53        15                       38         43

            38        48                       44         60

            50        63                       44         56

                                         869

                 SUM Ys = 869;     %S = ----- = 48,28.

                                         18

                           %Т     45,83

                      R = ----- = ------ = 0,949.

                           %S     48,28

                                         825

                 SUM Yт = 825;     %Т = ----- = 45,83.

                                          18

   Активность Т в ЕД, по данным этого опыта, равна:

                   Т = 0,949 х 40 = 37,96 ЕД в 1 мл.

       Определение проводят  не  менее  2  раз  с  каждым  испытуемым

   образцом  (Т).  Среднюю  величину  при  этом  получают,  объединяя

   индивидуальные  цифры  снижения  концентрации  сахара  в  крови  в

   процентах  в  обоих опытах.  При расчете окончательного результата

   должны быть использованы данные,  полученные не менее  чем  на  30

   кроликах.  Если  средняя  величина R,  по данным двух или большего

   числа  опытов,  будет  меньше  0,85  или  больше  1,15,  испытание

   проводят   заново,   исходя   из   новой  величины  предполагаемой

   активности испытуемого препарата.

       Кролики могут   быть  использованы  повторно  для  определения

   биологической активности не ранее чем через 2 нед после  окончания

   предшествующего опыта.  Продолжительность использования кроликов в

   опытах по определению биологической активности инсулина не  должна

   превышать 5 мес.

            Определение содержания сахара (глюкозы) в крови

       Содержание сахара    (глюкозы)   в   крови   при   определении

   биологической   активности   инсулина    чаще    всего    проводят

   феррицианидным  (метод  Хагедорна - Йенсена) или глюкозооксидазным

   методом,   однако   возможно   применение   и   других    методов.

   Рекомендуется    использование   готовых   наборов   реактивов   и

   автоматизированных приемов,  в частности автоматических  аппаратов

   для определения сахара (глюкозы) в крови.

       Феррицианидный метод (метод Хагедорна - Йенсена). К 5 мл 0,45%

   раствора  цинка сульфата в пробирке прибавляют 1 мл раствора натра

   едкого (0,1 моль/л) и затем 0,1 мл крови.  Пробирку помещают на  5

   мин в кипящую водяную баню, после чего смесь фильтруют в колбу для

   титрования через  воронку  с  ватой  (специально  приготовленной).

   Пробирку дважды промывают 3 мл воды. Промывные воды присоединяют к

   фильтрату. К фильтрату прибавляют 2 мл раствора калия феррицианида

   (красной  кровяной соли,  0,005 моль/л),  смесь помещают в кипящую

   водяную баню на 20 мин,  затем охлаждают в холодной воде.  К смеси

   прибавляют  3 мл хлорцинкйодистого ("тройного") раствора,  3 мл 3%

   раствора уксусной кислоты и 2 капли 1% раствора крахмала.

       Освободившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (0,005

   моль/л).  Параллельно  титруют  контрольную  пробу  (не содержащую

   крови), обработанную теми же реактивами.

       Количество натрия   тиосульфата,   пошедшего   на  титрование,

   зависит  от  концентрации  сахара  в   крови.   Эту   концентрацию

   рассчитывают с помощью табл.  11, составленной для раствора натрия

   тиосульфата (0,005  моль/л),  пошедшего  на  титрование  сахара  в

   пробе.  В первом вертикальном столбце указаны целые и десятые, а в

   верхнем горизонтальном  ряду  -  сотые  доли  миллилитра  раствора

   натрия тиосульфата.  На пересечении этих двух рядов находят цифру,

   выражающую концентрацию  сахара  (мг %)   в  титруемой  пробе.  Из

   опытной пробы вычитают контрольную пробу и получают  окончательную

   величину содержания сахара в крови кролика.

                                                           Таблица 11

            Расчет содержания сахара в миллиграммах в 0,1 мл

                  крови при использовании 0,005 моль/л

           раствора натрия тиосульфата (феррицианидный метод)

   -------------------------------------------------------------------

   |Тио- |            Сотые доли миллилитра тиосульфата              |

   |суль-|-----------------------------------------------------------|

   |фат, |0,00 |0,01 |0,02 |0,03 |0,04 |0,05 |0,06 |0,07 |0,08 |0,09 |

   |мл   |     |     |     |     |     |     |     |     |     |     |

   |-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----|

   |0,0  |0,385|0,382|0,379|0,376|0,373|0,370|0,366|0,364|0,361|0,358|

   |0,1  |0,355|0,352|0,350|0,348|0,345|0,343|0,341|0,338|0,336|0,333|

   |0,2  |0,331|0,329|0,327|0,325|0,323|0,321|0,318|0,316|0,314|0,312|

   |0,3  |0,310|0,308|0,306|0,304|0,302|0,300|0,298|0,296|0,294|0,292|

   |0,4  |0,290|0,288|0,286|0,284|0,282|0,280|0,278|0,276|0,274|0,272|

   |0,5  |0,270|0,268|0,266|0,264|0,262|0,260|0,259|0,257|0,255|0,253|

   |0,6  |0,251|0,249|0,247|0,245|0,243|0,241|0,240|0,238|0,236|0,234|

   |0,7  |0,232|0,230|0,228|0,226|0,224|0,222|0,221|0,219|0,217|0,215|

   |0,8  |0,213|0,211|0,209|0,208|0,206|0,204|0,202|0,200|0,199|0,197|

   |0,9  |0,195|0,193|0,191|0,190|0,188|0,186|0,184|0,182|0,181|0,179|

   |1,0  |0,177|0,175|0,173|0,172|0,170|0,168|0,166|0,164|0,163|0,161|

   |1,1  |0,159|0,157|0,155|0,154|0,152|0,150|0,148|0,146|0,145|0,143|

   |1,2  |0,141|0,139|0,138|0,136|0,134|0,132|0,131|0,129|0,127|0,125|

   |1,3  |0,124|0,122|0,120|0,119|0,117|0,115|0,113|0,111|0,110|0,108|

   |1,4  |0,106|0,104|0,102|0,101|0,099|0,097|0,095|0,093|0,092|0,090|

   |1,5  |0,088|0,086|0,084|0,083|0,081|0,079|0,077|0,075|0,074|0,072|

   |1,6  |0,070|0,068|0,066|0,065|0,063|0,061|0,059|0,057|0,056|0,054|

   |1,7  |0,052|0,050|0,048|0,047|0,045|0,043|0,041|0,039|0,038|0,036|

   |1,8  |0,034|0,032|0,031|0,029|0,027|0,025|0,024|0,022|0,020|0,019|

   |1,9  |0,017|0,015|0,014|0,012|0,010|0,008|0,007|0,005|0,003|0,002|

   -------------------------------------------------------------------

       Примечания. 1.  Приготовление  0,45%  раствора цинка сульфата.

   4,5 г цинка сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью

   1  л  и  доводят  объем  раствора  водой  до метки.  Срок годности

   раствора 7-10 сут.

       2. Приготовление хлорцинкйодистого ("тройного") раствора:  5 г

   цинка  сульфата  и  2,5  г  калия  йодида  растворяют  в  100   мл

   насыщенного   раствора   натрия   хлорида.   Раствор  должен  быть

   свежеприготовленным.

       3. Приготовление  раствора  натрия тиосульфата (0,005 моль/л):

   25 г натрия тиосульфата помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и

   растворяют   в   свежепрокипяченной  и  охлажденной  до  комнатной

   температуры воде.  Объем раствора в колбе доводят водой до  метки.

   Выдерживают   10   сут   в   защищенном   от  света  месте.  Перед

   употреблением полученный раствор разводят водой в 20 раз, для чего

   25 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 0,5 л, доводят

   водой до метки и тщательно взбалтывают.  Титр полученного раствора

   устанавливают с помощью раствора калия йодата (0,005 моль/л). Если

   раствор натрия тиосульфата  оказывается  менее  концентрированным,

   чем  0,005  моль/л,  то  по  каплям  прибавляют  основной  раствор

   тиосульфата.  Если раствор более концентрированный,  то прибавляют

   воду  и  добиваются,  чтобы  окончательный раствор был точно 0,005

   моль/л (для удобства подсчета).

       4. Приготовление раствора калия йодата (0,005 моль/л).  0,1782

   г калия йодата,  предварительно высушенного до  постоянной  массы,

   растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л.

       5. Приготовление раствора калия феррицианида  (0,005  моль/л):

   1,65 г калия феррицианида растворяют в небольшом количестве воды в

   мерной колбе вместимостью 1 л,  затем  прибавляют  10,6  г  натрия

   карбоната  безводного  (ГОСТ  83-79, х. ч.),  растворяют и доводят

   объем раствора водой до метки.  Срок годности раствора 2  мес  при

   хранении в темном месте.

       6. Приготовление  1%   раствора   крахмала:   1   г   крахмала

   растворимого  по  ГОСТ  10163-76  растворяют  в  100  мл  кипящего

   насыщенного раствора натрия хлорида и фильтруют через  вату.  Срок

   годности раствора 4 мес при хранении при комнатной температуре.

       7. Приготовление ваты:  вату (ГОСТ 5556-75) дважды  кипятят  в

   воде,  промывают  холодной  водой  и  сушат.  Перед  употреблением

   смачивают водой.

       Глюкозооксидазный метод. Кровь в количестве 0,1 мл смешивается

   с  1,1  мл  0,9%  изотонического   раствора   натрия   хлорида   в

   центрифужной пробирке.   Прибавляют   0,4  мл  5%  раствора  цинка

   сульфата и 0,4 мл раствора натра едкого (0,3 моль/л). Перемешивают

   и через 10 мин центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин.  К

   1 мл надосадочной жидкости прибавляют 3 мл энзимо  -  хромогенного

   реактива,  перемешивают  и  точно через 20 мин измеряют оптическую

   плотность раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине  волны

   625 нм против контрольной пробы,  где вместо надосадочной жидкости

   взята вода.  Время  с  момента  прибавления  энзимо - хромогенного

   реактива до измерения оптической плотности должно быть  одинаковым

   для   всех   проб.  Параллельно  проводят  определение  оптической

   плотности раствора стандартного образца  глюкозы  с  концентрацией

   100 мг%.

       Содержание глюкозы в пробе (X) рассчитывают по формуле:

                                  Dx

                             Х = ----- С

                                  Dст

   где Dx  - оптическая плотность испытуемой пробы;  Dст - оптическая

   плотность раствора стандартного образца глюкозы;  С - концентрация

   глюкозы в растворе стандартного образца.

       Примечания. 1.  Приготовление 5% раствора цинка сульфата: 50 г

   цинка сульфата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1 л и

   доводят объем раствора водой до метки. Срок годности раствора 7-10

   сут.

       2. Приготовление энзимо  -  хромогенного  реактива:  в  мерную

   колбу  вместимостью  100  мл  помещают  80-90 мл ацетатного буфера

   (0,25 моль/л,  рН 4,8),  в котором растворяют 2 мг глюкозооксидазы

   (ТУ  6-09- 10-1382-79),  а затем 1 мг пероксидазы (фирмы "Реанал",

   ВНР), прибавляют 1 мл  1%  раствора  о-толидина  и  доводят  объем

   раствора  ацетатным  буфером до метки.  Срок годности реактива 3-4

   нед. при хранении в защищенном от света месте при температуре от 8

   до 10 град. С.

       3. Приготовление  раствора ацетатного буфера (0,25 моль/л,  рН

   4,8):  раствор натрия ацетата (0,25 моль/л) смешивают с  раствором

   уксусной  кислоты  (0,25 моль/л) в соотношении 6:4.  Срок годности

   раствора 1 мес при хранении при температуре от 8 до 10 град. С.

       4. Приготовление раствора натрия ацетата (0,25 моль/л):  17  г

   натрия  ацетата  растворяют  в  небольшом количестве воды в мерной

   колбе вместимостью 500 мл и доводят объем раствора водой до метки.

       5. Приготовление  раствора  уксусной кислоты (0,25 моль/л):  в

   мерную колбу вместимостью 500  мл  наливают  небольшое  количество

   воды,  прибавляют 7,75 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем

   раствора водой до метки.

       6. Приготовление  раствора  натра  едкого  (0,3 моль/л):  12 г

   натра едкого растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1  л  и

   доводят объем раствора водой до метки.

       7. Приготовление 1% раствора о - толидина в абсолютном спирте:

   1 г о - толидина (ТУ 60911-788-76), свежеперекристаллизованного из

   спирта, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в

   небольшом  количестве  абсолютного  спирта  при   взбалтывании   и

   подогревании  на  кипящей  водяной бане.  После охлаждения доводят

   объем раствора абсолютным спиртом до метки. Срок годности раствора

   4  мес при хранении в защищенном от света месте при температуре от

   8 до 10 град. С.

       8. Перекристаллизация о - толидина: готовят насыщенный раствор

   о - толидина в горячем абсолютном спирте при нагревании на кипящей

   водяной бане. Фильтруют раствор через складчатый фильтр на воронке

   для горячего фильтрования.  Фильтрат охлаждают и приливают избыток

   охлажденной воды.   Выпавшие   кристаллы   о   -  толидина  быстро

   отсасывают на воронке Бюхнера и высушивают в вакуум  -  эксикаторе

   над кальция хлоридом.

       9. Приготовление  раствора  стандартного  образца  глюкозы  (5

   мг/мл):  0,5 г глюкозы,  предварительно высушенной  до  постоянной

   массы при температуре 37 град. С, растворяют в насыщенном растворе

   бензойной кислоты в мерной колбе вместимостью  100  мл  и  доводят

   объем раствора до метки раствором бензойной кислоты. Срок годности

   раствора 3 мес при температуре от 8 до 10 град. С.

       10. Приготовление насыщенного раствора бензойной кислоты:  0,1

   г бензойной кислоты (ГОСТ 10521-78) растворяют при  нагревании  до

   60-70  град.  С  до  полного  растворения  в  воде  в мерной колбе

   вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки.  Срок

   годности раствора 1 год.

               ИСПЫТАНИЕ НА ПРОЛОНГИРОВАННОЕ (УДЛИНЕННОЕ)

                      ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТОВ ИНСУЛИНА

       Испытание на  пролонгированное  действие  препаратов  инсулина

   основано  на сопоставлении длительности гипогликемического эффекта

   испытуемого препарата и стандартного образца инсулина.

       18 здоровых  кроликов массой 3-4 кг распределяют на две группы

   по 9 животных способом  случайного  выбора.  Животных  содержат  в

   отдельных  клетках,  за 18 ч до введения инсулина лишают корма (но

   не воды). В начале опыта у кроликов определяют исходное содержание

   сахара  в крови и рассчитывают среднюю концентрацию сахара в крови

   для каждой  группы.  Животным  первой  группы  вводят  стандартный

   образец  инсулина,  а животным второй группы - испытуемый препарат

   инсулина.  Навеску  стандартного  образца  инсулина  растворяют  в

   растворе  хлористоводородной  кислоты  (0,003  моль/л) рН 2,7-3,0,

   содержащем консервант в такой же  концентрации,  как  и  препарат.

   Доза  испытуемого  препарата и стандартного образца составляет 0,8

   ЕД на 1 кг массы тела  животного.  Испытуемый  препарат  вводят  в

   неразведенном   виде.   Концентрация   (количество   ЕД  в  1  мл)

   стандартного образца должна быть равна концентрации неразведенного

   испытуемого препарата.  Через 1,5; 3,0; 4,5 и 6,0 ч после введения

   препарата инсулина и стандартного образца определяют  концентрацию

   сахара в крови у кроликов и подсчитывают среднее содержание сахара

   для каждой группы.

       Требования в  отношении  пролонгированного  действия отдельных

   препаратов инсулина изложены в соответствующих частных статьях.

                        ИСПЫТАНИЕ НА ТОКСИЧНОСТЬ

       Испытание проводят на здоровых белых мышах обоего пола  массой

   19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний.

       За 24 ч до испытания и во время его проведения животные должны

   находиться  в  помещении  с  постоянной  температурой.  За  2 ч до

   взвешивания и отбора  животных  для  проведения  испытаний  у  них

   отбирают корм и воду.

       Каждую серию препарата испытывают на  5  мышах.  Растворитель,

   концентрация раствора (тест - доза) и способ  введения  указаны  в

   частных статьях.

       Раствор препарата,  подлежащего  испытанию,  подогревают до 37

   град. С и в  объеме  0,5  мл  вводят  в  хвостовую  вену  мыши  со

   скоростью 0,1 мл/с, если в частной статье нет других указаний.

       Если в  частной  статье  предусмотрен   иной   путь   введения

   препарата мышам,  объем раствора, вводимого в брюшную полость, под

   кожу или в желудок,  может быть  увеличен  до  1  мл.  Введение  в

   желудок производят шприцем посредством инъекционной иглы, на конце

   которой  имеется  наплавленная  олива,  или  при  помощи   другого

   приспособления,  обеспечивающего  поступление  раствора или взвеси

   препарата в желудок.

       Наблюдение за  животными ведут в течение 48 ч,  если в частной

   статье нет других указаний.

       Препарат считают   выдержавшим   испытание,   если  в  течение

   предусмотренного  срока  наблюдения  не  погибнет   ни   одна   из

   подопытных мышей.

       В случае гибели одной мыши опыт повторяют на 5 мышах массой 20

   +/-0,5 г;  в случае гибели при первоначальном испытании двух мышей

   повторное испытание проводят на 15 животных.  Если  при  повторном

   испытании ни одна мышь не погибнет, т.е. суммарная гибель животных

   в двух опытах не  превысит  10%,  препарат  считается  выдержавшим

   испытание. В противном случае препарат бракуют.

       Для испытания на токсичность отбирают по 2 флакона или  ампулы

   от каждой серии, содержащей не более 10000 флаконов или ампул. При

   количестве в серии флаконов или ампул более 10000  отбирают  по  3

   флакона  или  ампулы от каждой серии.  Для проведения испытания из

   отобранных флаконов или ампул  готовят  общий  раствор  (смешанная

   проба).   Общее  количество  отобранного  лекарственного  средства

   должно быть достаточным для проведения трех полных испытаний.

                       ИСПЫТАНИЕ НА ПИРОГЕННОСТЬ

       Испытание проводят  на  здоровых  кроликах  обоего  пола,   не

   альбиносах,   массой  2-3,  5  кг,  содержавшихся  на  полноценном

   рационе.  Каждый кролик должен находиться  в  отдельной  клетке  в

   помещении  с  постоянной  температурой.  Колебания  температуры не

   могут превышать +/-3 град.  С.  При уборке  клеток  и  взвешивании

   животных  их  оберегают  от  возбуждения  (избегать  шума и резких

   движений).

       В течение  недели,  предшествующей  опыту,  кролики  не должны

   терять в массе.  Взвешивание их проводят до дачи корма не менее  3

   раз через день.  Животные, теряющие в массе, к опыту непригодны. В

   течение 3 сут  перед  испытанием  у  каждого  подопытного  кролика

   измеряют  температуру.  Измерения проводят ежедневно утром до дачи

   корма при  помощи  медицинского  ртутного  или  электротермометра,

   позволяющего  определить  температуру с точностью до 0,1 град.  С.

   Датчик термометра вводят в прямую  кишку  на  глубину  7-9  см  (в

   зависимости  от  массы  кролика)  за внутренний сфинктер на время,

   необходимое  для  достижения  максимальной  температуры.  Исходная

   температура  подопытных  кроликов должна быть в пределах 38,5-39,5

   град.  С.  Животные с более высокой или более низкой  температурой

   для    опыта    непригодны.    Кроме   того,   кроликов,   впервые

   предназначаемых для испытания лекарственных средств,  проверяют на

   реактивность   путем   внутривенного   введения   10   мл/кг  0,9%

   стерильного     непирогенного     раствора     натрия     хлорида,

   соответствующего   требованиям   фармакопейной  статьи.  В  случае

   изменения температуры у кроликов  более  чем  на  +/-0,4  град.  С

   животные считаются непригодными для опыта.

       Не позднее  чем  за  18  ч  до  опыта  кроликов  переводят   в

   помещение,  в котором осуществляют испытание на пирогенность.  Оно

   должно проводиться в отдельной комнате с постоянной  температурой,

   не  отличающейся  от  температуры  помещения,  в  котором  кролики

   постоянно содержались до опыта,  более чем на +/-2 град.  С,  и  с

   колебаниями  во  время  испытания,  не  превышающими  2  град.  С,

   изолированной от шума,  в спокойной обстановке.  Вечером  накануне

   опыта  у  животных  отбирают  остаток  корма.  До и во время опыта

   животные корма не получают (воду дают без ограничения).

       Если нет  других  указаний  в  частной  статье,  для испытания

   отбирают не менее 2 флаконов или ампул от каждой серии, содержащей

   от  1000  до  10000  флаконов  или  ампул.  При количестве в серии

   флаконов или ампул более 10000 отбирают по 3 флакона или ампулы от

   каждой  серии.  Из  отобранных  флаконов  или  ампул готовят общий

   раствор (смешанная проба).  От серии,  содержащей до 1000 флаконов

   или ампул, для испытания отбирают по 1 флакону или ампуле.

       Вода для инъекций или другие применяемые растворители, а также

   шприцы и иглы должны быть стерильными и непирогенными.  Испытуемые

   лекарственные средства должны быть стерильными. Их вводят кроликам

   в  ушную вену.  Другие пути введения указывают в частной статье на

   лекарственное средство.  Для каждого кролика берут отдельную иглу.

   Растворы испытуемых лекарственных средств,  подогретые до 37 град.

   С (при отсутствии других указаний в  частных  статьях),  вводят  в

   количествах   и  растворителях,  предусмотренных  соответствующими

   частными статьями. Для испытания на пирогенность воды для инъекций

   предварительно  готовят  из нее изотонический 0,9%  раствор натрия

   хлорида.  Натрия хлорид должен быть стерильным и непирогенным, что

   обеспечивается  воздушным методом его стерилизации при температуре

   180 или 200 град.  С в течение от 30 до 60 мин  в  зависимости  от

   массы  образца.  Шприцы,  иглы  и  необходимую  стеклянную  посуду

   стерилизуют этим же методом при температуре 180 град.  С в течение

   60 мин.  Количество вводимого изотонического 0,9%  раствора натрия

   хлорида составляет 10 мл на 1 кг  массы  кролика.  Все  количество

   раствора, предварительно нагретого до 37 град. С, вводят в течение

   2 мин.

       Испытуемый раствор  проверяют  на  3  кроликах.  Группа должна

   состоять из животных,  близких по массе (отличающихся не более чем

   на 0,5 кг). Перед введением раствора у кролика дважды с интервалом

   30 мин измеряют температуру. Различия в показателях температуры не

   должны  превышать  0,2  град.  С.  В  противном  случае кролик для

   испытания  не   используется.   Результат   последнего   измерения

   принимают  за исходную температуру.  Раствор вводят не позднее чем

   через 15-30 мин после последнего измерения температуры.

       Последующее измерение  температуры  при  внутривенном введении

   испытуемого раствора проводят 3 раза с промежутками  в  один  час.

   При других путях введения - 5 раз с промежутками в один час,  если

   в частной статье нет других указаний.

       Воду для  инъекций или раствор лекарственного средства считают

   непирогенными,  если сумма  повышений  температуры  у  3  кроликов

   меньше или равна 1,4 град.  С.  Если эта сумма превышает 2,2 град.

   С,  то воду  для  инъекций  или  раствор  лекарственного  средства

   считают пирогенными.  В случаях, когда сумма повышений температуры

   у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2 град. С, испытание

   повторяют  дополнительно  на  5  кроликах.  В этом случае воду для

   инъекций   или    раствор    лекарственного    средства    считают

   непирогенными,  если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов

   не превышает 3,7 град.  С. Если же эта сумма равна 3,8 град. С или

   больше,  воду  для  инъекций  или  раствор лекарственного средства

   считают пирогенными.

       В частной  фармакопейной  статье  могут  быть  указаны  другие

   пределы отклонения температуры.

       Если в  частной  статье  на  лекарственное средство нет других

   указаний,  случаи понижения температуры у  кроликов  принимают  за

   нуль.

       Кролики, бывшие  в  опыте,   могут   быть   использованы   для

   определения  пирогенности  повторно,  но не ранее чем через 3 сут,

   если введенный им до этого  раствор  лекарственного  средства  или

   вода  для  инъекций были непирогенными.  Если же введенный раствор

   лекарственного  средства   или   вода   для   инъекций   оказались

   пирогенными, кролики могут быть использованы для дальнейших опытов

   через 2 нед.  При повышении  температуры  у  кроликов  в  подобных

   случаях на 1,2 град.  С и более они используются через 3 нед. Если

   исследуемые вещества обладают антигенными свойствами,  то одних  и

   тех  же  кроликов нельзя использовать для испытания повторно (если

   нет специальных указаний в частной статье).

       Примечания. На  основании  опыта  контроля   на   пирогенность

   медицинских   иммунобиологических  препаратов  (МИБП)  допускаются

   следующие особенности при испытании этих препаратов.

       1. Испытание МИБП проводят на кроликах массой 1,5-2,5 кг.

       2. Проверка реактивности кроликов является необязательной.

       3. Термометр  вводят  в  прямую  кишку  на  глубину  5-7 см (в

   зависимости от массы кролика).

       4. Понижение температуры учитывают так же, как ее повышение.

       5. Кролики,  бывшие  в  опыте,  могут  быть  использованы  для

   определения пирогенности повторно (но не более 3 раз) с интервалом

   2-3 сут,  если ранее введенный  препарат  был  непирогенным.  Если

   введенный  препарат  оказался  пирогенным,  кролики  не могут быть

   использованы повторно.

                    ИСПЫТАНИЕ НА СОДЕРЖАНИЕ ВЕЩЕСТВ

                      ГИСТАМИНОПОДОБНОГО ДЕЙСТВИЯ

       Настоящая фармакопейная   статья  является  общей  и  касается

   метода испытания на содержание веществ гистаминоподобного действия

   лекарственных   средств,   предназначенных   для   парентерального

   применения.

       Испытание проводят  на кошках обоего пола массой не менее 2 кг

   под уретановым наркозом.  Уретан вводят внутрибрюшинно из  расчета

   1-1,2 г на 1 кг массы животного в 3-5 мл дистиллированной воды.  В

   случае  недостаточной   глубины   наркоза   вводят   дополнительно

   внутривенно  уретан  в  количестве 1 г в 3 мл воды на животное или

   этаминал -  натрий  в  виде  2%  раствора  в  количестве 0,2 мл/кг

   внутривенно.  Скорость  введения  указанных  растворов  0,1  мл  в

   секунду.

       Допускается также   применение   в   качестве   наркотического

   средства гексенала в дозе 350-400 мг/кг в 2-3 мл воды под кожу или

   внутримышечно.

       Для регистрации  артериального  давления  в  отпрепарированную

   сонную    артерию   вставляют   канюлю,   заполненную   раствором,

   предупреждающим  свертывание  крови  (насыщенный  раствор   натрия

   гидрокарбоната,   25%  раствор магния сульфата,  раствор гепарина,

   содержащий 50 ЕД в  1  мл,  и  др.),  и  соединяют  ее  с  ртутным

   манометром. Запись давления производят на ленте кимографа.

       Испытуемые растворы вводят внутривенно.

       Вначале проверяют чувствительность животного к гистамину.

       Для приготовления основного раствора гистамина,  содержащего 1

   мг гистамина - основания в 1  мл  воды,  около  138,1  мг  (точная

   навеска)  гистамина  фосфата  или  около  82,8 мг (точная навеска)

   гистамина дигидрохлорида растворяют в 50 мл дистиллированной воды.

       Раствор хранят не более 1 мес в склянке из  темного  стекла  с

   притертой пробкой в защищенном от света месте при температуре от 4

   до 10 град. С.

       В качестве  основного  раствора  гистамина  можно использовать

   также 0,1%   раствор гистамина дигидрохлорида в ампулах,  в  1  мл

   которого содержится 0,6038 мг гистамина - основания.

       Из основного раствора гистамина непосредственно  перед  опытом

   путем последовательных разведений в воде  или  в  растворе  натрия

   хлорида   изотонического   0,9%  для  инъекций  в  зависимости  от

   растворителя   для    испытуемого    препарата,    указанного    в

   соответствующей статье,  готовят стандартные растворы,  содержащие

   0,5 и 1 мкг/мл гистамина - основания.

       Для проверки   реакции   животного   на   гистамин   в    вену

   последовательно    вводят   указанные   стандартные   растворы   с

   промежутками  не  менее  5   мин   в   дозах   0,1   и   0,2   мкг

   гистамина - основания в 0,2 мл на 1 кг  массы.  Скорость  введения

   раствора  0,1  мл  в  секунду.  Животных,  у  которых при введении

   гистамина в дозе 0,2 мкг  на  1  кг  массы  артериальное  давление

   снизится менее чем на 20 мм рт. ст., из опыта исключают.

       После проверки чувствительности животного к гистамину уточняют

   величину  гипотензивной  реакции  посредством  повторного введения

   стандартного раствора гистамина в дозе 0,1 мкг (0,2  мл  раствора)

   на 1 кг массы со скоростью 0,1 мл  в секунду. Введение гистамина с

   интервалом  5  мин  повторяют  несколько  раз,   пока   при   двух

   последовательных  введениях  не будет получено одинаковое снижение

   артериального  давления,  которое  принимается  за  стандартное  в

   данных условиях опыта.

       Затем с интервалом не менее 5 мин животному вводят  испытуемый

   раствор  лекарственного  средства  с  той же скоростью,  с которой

   вводили раствор гистамина.

       Растворитель и концентрация испытуемого раствора (тест - доза)

   указаны в соответствующей фармакопейной статье.  Препарат  считают

   выдержавшим испытание,  если снижение артериального давления после

   введения тест - дозы не превышает реакции на введение  0,1  мкг/кг

   гистамина в стандартном растворе.

       При испытании  в  одном  опыте  разных  лекарственных  средств

   необходимо  проводить дополнительное определение реакции животного

   на введение стандартного раствора гистамина  в  дозе  0,1  мкг/кг.

   Отмеченная  при  этом величина реакции принимается как стандартная

   для последующего испытания препарата.

       В случае   значительного   уменьшения   величины   реакции  по

   сравнению с наблюдаемой в начале опыта необходимо вновь  проверить

   чувствительность животного к действию гистамина в дозе 0,2 мкг/кг.

   Если снижение артериального давления при этом будет не менее 20 мм

   рт.   ст.,   испытание  препаратов  продолжают  в  соответствии  с

   указанными выше требованиями,

       Для испытания   на   содержание   веществ   гистаминоподобного

   действия отбирают  по  2  флакона  или  ампулы  от  каждой  серии,

   содержащей  не  более  10000 флаконов или ампул.  При количестве в

   серии флаконов или ампул более 10000 отбирают  по  3  флакона  или

   ампулы  от каждой серии.  Из отобранных флаконов или ампул готовят

   общий раствор (смешанная проба) для испытаний.

                  МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ

                         ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

                       ИСПЫТАНИЕ НА СТЕРИЛЬНОСТЬ

       Лекарственные средства  для  инъекций,  глазные  капли,  мази,

   пленки, другие лекарственные средства, в отношении которых имеются

   соответствующие указания  в  нормативно - технической документации

   (НТД), должны быть стерильными. Стерильность лекарственных средств

   достигается соблюдением  необходимых  санитарно  -   гигиенических

   условий их изготовления и режима стерилизации.

       Методы контроля  стерильности,  изложенные  в  данной  статье,

   применяют для испытания всех лекарственных средств  независимо  от

   их  природы  и  лекарственной  формы,  если  нет других указаний в

   частных фармакопейных статьях.

       Отбор образцов  для  анализа.  Образцы  готовых  лекарственных

   средств отбирают для  контроля  от  каждой  серии  в  количествах,

   зависящих  от вида стерилизации и числа единиц (ампул,  флаконов и

   т.д.) в серии.

       В случае,  если  лекарственное средство стерилизуют насыщенным

   паром при  избыточном  давлении  0,11 +/- 0,02   МПа  (1,1 +/- 0,2

   кгс/кв. см)  и температуре (121 +/- 1) град. С, образец состоит из

   10 единиц.  При других видах стерилизации  минимальное  количество

                                                        ---

   образцов для анализа определяют по формуле n = 0,4 \/ N , где  n -

   число единиц  в  образце,  а  N - число единиц в исследуемой серии

   препарата, при этом n должно быть не менее 3 и не более 40.

       Определение антимикробного  действия  лекарственного средства.

   Во избежание неправильной оценки  результатов  анализа  необходимо

   определить  однократно  для  каждого  наименования  лекарственного

   средства, обладает ли оно антимикробным действием. Для этого в две

   пробирки  с  10  мл  тиогликолевой  среды  и в две - с 10 мл среды

   Сабуро   добавляют   соответствующее    количество    исследуемого

   лекарственного  средства (табл.  12) и вносят в каждую пробирку по

   0,1 мл микробной взвеси соответствующего тест - штамма, содержащей

   1000  клеток  в 1 мл.  Посевы в тиогликолевой среде инкубируют при

   температуре от 30 до 35 град.  С в течение 48 ч, а на среде Сабуро

   - при температуре от 20 до 25 град. С в течение 72 ч.

       Контролем служат пробирки с питательными  средами,  в  которые

   вместо   данного   лекарственного   средства   вносят  аналогичное

   количество    дистиллированной    воды    или     соответствующего

   растворителя.

       Для проверки антибактериального действия лекарственных средств

   используют тест - микроорганизмы:  Staphylococcus aureus АТСС 6538

   Р,  Bacillus  subtilis ATCC 6633,  Escherichia coli ATCC 25922,  а

   противогрибкового действия - Candida albicans  ATCC  885-653  (см.

   табл. 13).

       При отсутствии антимикробного действия лекарственного средства

   в контрольных и опытных пробирках (колбах) должен наблюдаться рост

   перечисленных тест - микроорганизмов.

       При наличии  антимикробного  действия  лекарственных   средств

   используют   соответствующие  инактиваторы,  указанные  в  частных

   фармакопейных статьях:  (напр.:  пара - аминобензойная кислота для

   сульфаниламидов, пенициллиназа - для пенициллинов и цефалоспоринов

   и т.д.).  При отсутствии инактиватора препарат  разводят,  изменяя

   соотношение  объемов  посевного  материала  и  питательной  среды.

   Первоначально,  не   изменяя   количества   посевного   материала,

   указанного в табл.  12, увеличивают объем питательной среды до 250

   мл.   Если   при   этом   сохраняется    антимикробное    действие

   лекарственного средства,  уменьшают объем посевного материала до 1

   мл.

       В случае  неэффективности  разведения  лекарственного средства

   используют метод мембранной фильтрации.

       Посев лекарственных   средств.   Для   контроля   стерильности

   лекарственных средств применяют тиогликолевую среду и жидкую среду

   Сабуро.  При  этом  используют метод прямого посева на питательные

   среды или метод мембранной фильтрации.

       Метод прямого  посева.  Испытуемый препарат,  если необходимо,

   растворяют   в   соответствующем   растворителе   и   высевают   в

   количествах, указанных в табл. 12.

       При испытании лекарственных  средств  посевы  в  тиогликолевой

   среде  инкубируют при температуре от 30 до 35 град.  С,  а в среде

   Сабуро - от 20 до 25 град.  С. Продолжительность инкубации посевов

   в обеих питательных средах составляет 14 сут.

                                                           Таблица 12

              Количество испытуемого препарата для посева

               в зависимости от объема содержимого единиц

              (ампул, флаконов и др.), составляющих серию

   ------------------------------------------------------------------

   |Объем содержимого|     Объем    |   Объем питательной среды     |

   |одной единицы, мл|лекарственного|                               |

   |                 | средства для |                               |

   |                 |  посева, мл  |                               |

   |-----------------+--------------+-------------------------------|

   |Менее 1          |Весь объем    |В 10 раз больше объема образца |

   |1 - 4            |1             |для посева                     |

   |5 - 19           |2             |                               |

   |20 - 100         |2 - 4         |                               |

   |Более 100 <*>    |10            |                               |

   ------------------------------------------------------------------

       --------------------------------

       <*> Если  объем  содержимого   единицы   превышает   100   мл,

   предпочтительнее использовать метод мембранной фильтрации.

       В случае  помутнения  питательной  среды  после внесения в нее

   испытуемого препарата следует в интервале от 3  до  7  сут.  после

   посева  сделать пересев на свежие аналогичные среды и инкубировать

   их при соответствующей температуре 14 сут от начала испытания.

       При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах

   отбирают асептически по 0,1 г (мл) от каждой единицы  и  вносят  в

   стерильную колбу вместимостью 250 мл,  содержащую стеклянные бусы,

   100 мл 1/15 мол  фосфатного  буферного  раствора  (рН  6,8-7,0)  и

   эмульгатор.   Перед   проведением   испытания   содержимое   колбы

   подогревают до температуры (41 +/-1) град.  С.  Колбу с испытуемым

   образцом  встряхивают  не  более  30  мин  до получения однородной

   эмульсии.  Полученную эмульсию в количестве 5 мл переносят в колбу

   с 40 мл тиогликолевой среды и 5 мл - в колбу с 40 мл среды Сабуро.

   Посевы инкубируют  14  сут  при  соответствующей  температуре  для

   каждой питательной среды.

       Примечания. 1.  Выбор эмульгатора и его количество зависят  от

   природы мази и растворов лекарственных средств в маслах.  Наиболее

   часто применяют твин-80 в концентрации  до  2,5%,  не  оказывающей

   антимикробного действия.

       2. При испытании мазей, легко эмульгируемых в воде, эмульгатор

   не вносят в буферный раствор.

       3. При испытании мазей и растворов в  маслах  предпочтительнее

   использовать метод мембранной фильтрации.

       Метод мембранной  фильтрации.  При  определении   стерильности

   лекарственных   средств,   обладающих   выраженным   антимикробным

   действием,  и лекарственных средств,  разлитых в емкости более 100

   мл, используют метод мембранной фильтрации.

       При испытании лекарственных средств с антимикробным  действием

   от  каждой  серии  независимо  от  ее  объема отбирают 30 емкостей

   (ампул, флаконов и др.), которые делят на 3 группы по 10 емкостей.

   Емкости   двух   групп  (20  штук)  используют  для  испытания  на

   стерильность,  третьей группы (10 штук)  -  для  контроля  полноты

   отмывания мембраны от лекарственного средства.

       Испытание лекарственного средства на стерильность  проводят  с

   использованием      фильтрационной      установки,      включающей

   фильтродержатель,   соединенный    с    колбой    -    приемником.

   Фильтродержатель  состоит  из  воронки  с  крышкой  и основания из

   пористой  пластины,  на  которую  помещают  мембрану.   Используют

   мембраны  с размером пор 0,45 +/-0,02 мкм,  диаметром около 47 мм.

   Испытания проводят под вакуумом 93,3  кПа  (70  см  рт.  ст.)  при

   скорости   вытекания   воды   55-75   мл   в  1  мин.  Допускается

   использование аппарата, представляющего собой стерильную замкнутую

   систему и работающего также по принципу фильтрации растворов.

       Для фильтрации  водных,   масляных   и   спиртовых   растворов

   рекомендуют  использовать  фильтры  из эфиров целлюлозы или смесей

   эфиров  целлюлозы.  Фильтровальную  установку  в  собранном   виде

   стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении 0,11 +/- 0,02

   МПа [(1,1 +/- 0,2) кгс/кв. см] и температуре (121 +/-1) град. С  в

   течение  20  мин (температура и время критические).   Стерилизацию

   можно   осуществлять   любым   другим   способом,   обеспечивающим

   сохранность  рабочих характеристик мембраны,  а также стерильность

   мембраны и всей установки (ионизирующее излучение, окись этилена и

   т.п.).

       Испытуемое лекарственное средство растворяют или  суспендируют

   (если  в  этом  есть  необходимость)  в соответствующей стерильной

   жидкости и  полученный  раствор  или  суспензию  пропускают  через

   стерильную  мембрану.  Для  растворения  лекарственных  средств  с

   антимикробным  действием  и  отмывания  мембраны  от   них   можно

   использовать    любой    растворитель,    не   подавляющий   роста

   микроорганизмов, например,  раствор натрия хлорида  изотонического

   0,9%  для инъекций.  Используемый растворитель перед стерилизацией

   необходимо профильтровать через мембраны с  порами  размером  0,45

   +/-0,02 мкм для освобождения от механических примесей.

       Фильтрование отобранных  образцов  проводят   в   асептических

   условиях.  Испытуемый  раствор  пропускают с помощью вакуума через

   одну или несколько мембран.  При испытании лекарственных средств с

   антимикробным  действием или содержащих консервант после окончания

   фильтрации мембрану необходимо промыть  3-5  порциями  по  100  мл

   соответствующего  растворителя,  например растворам натрия хлорида

   изотонического  0,9%  для инъекций или жидкости N 1 (см.  с. 193),

   при испытании мазей - жидкости N 2 (см.  с.  193). После отмывания

   мембраны ее извлекают,  разрезают стерильными ножницами пополам  и

   одну  половину  помещают  в  колбу  со 100 мл тиогликолевой среды,

   вторую - в колбу со 100  мл  среды  Сабуро.  Питательные  среды  с

   помещенными  в  них фильтрами выдерживают при температуре от 30 до

   35 град.  С (тиогликолевая среда) и от 20 до  25  град.  С  (среда

   Сабуро) в течение 7 суток при ежедневном просмотре.

       Для контроля  стерильности  растворов  лекарственных  средств,

   выпускаемых  в виде порошков,  лиофилизированных препаратов и пр.,

   содержимое каждой емкости предварительно растворяют  в  стерильном

   растворителе.  Затем  из  каждых 10 емкостей одной группы отбирают

   полученный  раствор   в   количестве,   соответствующем   200   мг

   лекарственного  средства,  и переносят в колбу,  содержащую 100 мл

   аналогичного  растворителя.  Приготовленный   раствор   немедленно

   фильтруют.   После  отмывания  фильтра,  как  указано  выше,  одну

   половину его помещают в колбу с тиогликолевой средой,  вторую -  в

   колбу со средой Сабуро.

       При испытании мазей и растворов лекарственных средств в маслах

   от  каждой  из 10 емкостей отбирают по 100 мг препарата в колбу со

   100   мл   растворителя   (изопропилмиристат   и   др.),   который

   предварительно  подогревают  до  температуры не выше 45 град.  С и

   стерилизуют фильтрованием   через   мембраны   с   размером    пор

   (0,22 +/-  0,02) мкм.  После фильтрации образца мембрану промывают

   двумя - тремя порциями по 200 мл жидкости N  2  и  затем  одной  -

   двумя   порциями  жидкости  N  1.  Половину  мембраны  помещают  в

   тиогликолевую  среду,  другую  -  в  среду   Сабуро,   в   которые

   предварительно вносят стерильный твин-80 из расчета 1 г на 1000 мл

   среды.

       При испытании  лекарственных  средств,  разлитых   в   емкости

   большого   объема,   через   фильтры  пропускают  содержимое  5-10

   емкостей,  если объем каждой емкости составляет от 100 до 500  мл.

   При  наличии  в  емкости  более  500  мл  раствора на стерильность

   испытывают по 500 мл содержимого каждой из 5- 10 емкостей  на  2-3

   мембранах.

       При испытании  лекарственных  средств,  представляющих   собой

   вязкую  жидкость или медленно фильтрующиеся суспензии,  необходимо

   предварительно добавить растворитель,  указанный в частной статье,

   для увеличения скорости фильтрации.

       Контроль полноты отмывания фильтра  (третья  группа  емкостей)

   проводят   следующим  образом:  при  испытании  антибактериального

   лекарственного  средства  в  колбу  с   тиогликолевой   средой   и

   погруженной  в  нее  половиной  фильтра  вносят  суточную культуру

   Staphylococcus aureus ATCC 6538 Р, при испытании противогрибкового

   лекарственного  средства  -  в  колбу  со средой Сабуро и фильтром

   вносят  48-часовую  культуру  Candida  albicans  ATCC  885-653  из

   расчета  100  микробных  клеток  на  весь  объем среды.  Инкубацию

   проводят   при   соответствующих   температурах.   Наличие   роста

   тест -   микроорганизмов   в  контрольных  колбах  через  48-72  ч

   свидетельствует  о  достаточной  полноте  отмывания   мембран   от

   антимикробного лекарственного средства.

       Для контроля  стерильности   условий,   в   которых   проводят

   испытания,  необходимо  фильтровать  растворитель  без испытуемого

   лекарственного  средства  с  последующим   воспроизведением   всех

   вышеописанных операций.

       Учет и интерпретация результатов  испытания  на  стерильность.

   Посевы  просматривают  в рассеянном свете ежедневно и по окончании

   периода инкубации.  Наличие роста  микроорганизмов  в  питательных

   средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и

   других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов

   необходимо  подтвердить  микроскопированием мазков,  окрашенных по

   Граму.

       Испытуемый препарат    считают   удовлетворяющим   требованиям

   испытания на стерильность при  отсутствии  роста  микроорганизмов.

   При  обнаружении  роста хотя бы в одной пробирке (колбе,  флаконе)

   его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком

   же количестве образцов,  как и в первый раз.  При отсутствии роста

   микроорганизмов при повторном посеве испытуемый  препарат  считают

   удовлетворяющим  требованию  испытания  на стерильность.  В случае

   роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных

   с  микроорганизмами,  выявленными  в первичном посеве,  испытуемый

   препарат  считают  нестерильным.   Если   при   повторном   посеве

   наблюдается  рост  микроорганизмов,  отличающихся по морфологии от

   первоначально выделенных,  испытание повторяют  в  третий  раз  на

   удвоенном    количестве    образцов.    При    отсутствии    роста

   микроорганизмов  после  инкубации  посевов  в  третьем   испытании

   испытуемый   препарат   считают   удовлетворяющим  требованиям  на

   стерильность.  При  наличии  роста  хотя  бы  в   одной   пробирке

   испытуемый препарат считают нестерильным.

                           Питательные среды

       Для контроля  стерильности  применяют "Сухую питательную среду

   для   контроля   стерильности"   (тиогликолевую)    отечественного

   производства  (ТУ 42.14 N 161-79) и среду Сабуро (жидкую).  Вместо

   коммерческой   тиогликолевой   среды   может   быть   использована

   тиогликолевая среда индивидуального приготовления.

       Состав и приготовление питательных сред.  Тиогликолевая  среда

   индивидуального приготовления:

       панкреатического гидролизата казеина      15,0  г

       дрожжевого экстракта (10%)                 5,0  >>

       натрия хлорида                             2,5  >>

       глюкозы                                    5,0  >>

       цистина (цистеина)                         0,75 >>

       тиогликолевой кислоты или                  0,3  мл

       тиогликолята натрия                        0,5  г

       раствора резазурина натрия 1:1000

       (свежеприготовленного) <*>                 1,0  мл

       агара                                      0,75 г

       воды дистиллированной                до 1000    мл

       рН после стерилизации                      7,0 +/- 0,2

       --------------------------------

       <*> Допускается приготовление среды без резазурина натрия.

       Тиогликолевую среду можно хранить в  течение  14  сут  со  дня

   приготовления при температуре от 10 до 25 град.  С в защищенном от

   света месте.

       В случае,  если  при  хранении  среды,  содержащей  резазурин,

   верхний слой среды (более 1/3 объема) окрасится  в  розовый  цвет,

   среду  можно  регенерировать нагреванием на кипящей водяной бане в

   течение 10-15 мин до исчезновения розовой  окраски  с  последующим

   быстрым  охлаждением.  В  случае,  если  окраска не исчезает после

   нагревания,  среду считают непригодной к употреблению. Регенерацию

   среды можно проводить только один раз.

       Среда Сабуро:

                  пептона ферментативного         10 г

                  глюкозы                         40 >>

                  воды дистиллированной      до 1000 мл

                  рН после стерилизации            5,6 +/- 0,2

       Обе среды стерилизуют насыщенным паром при избыточном давлении

   0,11 +/-0,02 МПа (1,1 +/-0,2 кгс/кв.  см) и при  температуре  (121

   +/-1) град. С в течение 15 мин.

       Жидкость N 1:

                  пептона ферментативного          1 г

                  воды дистиллированной      до 1000 мл

                  рН после стерилизации            7,1 +/-0,2

       Жидкость N 2:

                  пептона  ферментативного         5 г

                  твина-80                        10 г

                  воды дистиллированной      до 1000 мл

                  рН после стерилизации            7,1 +/-0,2

       Жидкости разливают в колбы по 100 мл и стерилизуют так же, как

   и питательные среды.

       Требования к    ростовым    свойствам    питательных     сред.

   Тиогликолевая  среда  и среда Сабуро должны обеспечивать визуально

   обнаруживаемый рост соответствующих  тест  -  штаммов  аэробных  и

   анаэробных бактерий и грибов (предусмотренных НТД).

       Используемые питательные  среды   должны   обеспечивать   рост

   микроорганизмов   при   посеве   их   в   количестве   менее   100

   жизнеспособных клеток:  для тиогликолевой среды - не позднее 48  ч

   инкубации при температуре от 30 до 35 град. С и для среды Сабуро -

   не позднее 72 ч инкубации при температуре от 20 до 25 град. С.

                ИСПЫТАНИЕ НА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКУЮ ЧИСТОТУ

       Лекарственные средства (таблетки,  капсулы, гранулы, растворы,

   экстракты,  сиропы,  мази  и  др.),  не  стерилизуемые  в процессе

   производства,  могут  быть  контаминированы   микроорганизмами   и

   поэтому должны быть испытаны на микробиологическую чистоту.

                                                           Таблица 13

                Тест - микроорганизмы, используемые для

           определения антимикробного действия лекарственных

              средств и ростовых свойств питательных сред

   ------------------------------------------------------------------

   | N по Каталогу   |                                 |            |

   |    штаммов      |                                 |Питательная |

   |  Всесоюзного    |          Тест - штаммы          |   среда    |

   |музея патогенных |                                 |     N      |

   |бактерий ГИСК им.|                                 |            |

   | Л.А.Тарасевича  |                                 |            |

   |-----------------+---------------------------------+------------|

   |     010011      |Bacillus subtilis ATCC 6633      |     1      |

   |     010014      |Bacillus cereus ATCC 10702       |     1      |

   |     240533      |Escherichia coli ATCC 25922      |     3      |

   |                 |                                 |     6      |

   |                 |                                 |     7      |

   |     190155      |Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 |     9      |

   |     201108      |Staphylococcus aureus ATCC 6538-P|    10      |

   |                 |                                 |     8      |

   |-----------------+---------------------------------+------------|

   |N в коллекции    |                                 |            |

   |патогенных       |                                 |            |

   |грибов  НИО      |                                 |            |

   |глубоких микозов |                                 |            |

   |Ленинградского   |                                 |            |

   |ГИДУВ            |                                 |            |

   |-----------------+---------------------------------+------------|

   |      259        |Candida albicans ATCC 885-653    |     2      |

   ------------------------------------------------------------------

       Испытание на      микробиологическую      чистоту     включает

   количественное определение жизнеспособных  бактерий  и  грибов,  а

   также   выявление   определенных  видов  микроорганизмов,  наличие

   которых недопустимо в нестерильных лекарственных средствах.

       Испытание проводят    в    асептических   условиях,   применяя

   приведенные методы и питательные среды  для  контроля  всех  видов

   нестерильных лекарственных средств, а также сырья, используемого в

   их производстве.

       Лекарственные средства,  обладающие антимикробным действием, и

   консерванты,   входящие   в    состав    некоторых    нестерильных

   лекарственных   средств,  могут  подавлять  рост  отдельных  видов

   микроорганизмов в условиях проведения испытания.

       Во избежание   неправильной   оценки   результатов   испытания

   определяют действие лекарственного средства в отношении  следующих

   тест -  микроорганизмов:  Bacillus  subtilis  (Bacillus   cereus),

   Escherichia coli,  Pseudomonas aeruginosa,  Staphylococcus aureus,

   Candida albicans, указанных в табл. 13.

       Определение антимикробного действия  лекарственного  средства.

   Пять  образцов лекарственного средства по 1 г (мл) каждый разводят

   в соотношении  1:10  фосфатным  буферным  раствором  рН  7,0  (два

   образца), средой N 3 (один образец) и средой N 8 (два образца).

       Культуры Bacillus  subtilis  (Bacillus  cereus),   Escherichia

   coli,  Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus выращивают на

   жидкой среде  N  1  при температуре от 30 до 35 град.  С в течение

   18-20 ч,  культуру Candida albicans - на  жидкой  среде  N  2  при

   температуре от 20 до 25 град.  С в течение 48 ч. Культуры разводят

   1:1000 стерильным 0,9%  раствором  натрия  хлорида  изотоническим,

   вносят  по  1  мл  взвеси  каждого тест - штамма (в отдельности) в

   приготовленные образцы лекарственного средства в буферном растворе

   (Bacillus  subtilis,  Candida albicans),  в среде N 3 (Escherichia

   coli) и  в  среде  N  8  (Pseudomonas  aeruginosa,  Staphylococcus

   aureus).   Для   выявления   микроорганизмов   используют  методы,

   приведенные в данной статье.  В случае  отсутствия  роста  тест  -

   штаммов    на    соответствующих   питательных   средах   отмечают

   антимикробное действие лекарственного средства.

       Для устранения антимикробного действия лекарственного средства

   используют    различные    методы:   1)   увеличивают   разведение

   лекарственного  средства,  взяв  больший  объем  растворителя;  2)

   добавляют  необходимое  количество соответствующего специфического

   инактиватора,     нейтрализующего      антимикробное      действие

   лекарственного  средства,  но  не угнетающего рост микроорганизмов

   (например,  пенициллиназу -  для  пенициллинов  и  цефалоспоринов,

   пара -   аминобензойную   кислоту   -   для  сульфаниламидов);  3)

   комбинируют методы 1 и 2; 4) вводят неспецифические инактиваторы в

   питательные    среды,    нейтрализующие   антимикробное   действие

   лекарственного  средства  (например,  4%  твина-80,  0,5%  соевого

   лецитина);  5)  если все вышеперечисленные методы неэффективны,  а

   лекарственное средство  растворимо,  используют  метод  мембранной

   фильтрации;  6)  если  в  связи с природой лекарственного средства

   нельзя   использовать   метод   мембранной   фильтрации,   а   все

   вышеперечисленные  методы устранения его антимикробного действия в

   отношении данного тест - штамма неэффективны,  этот вид  испытания

   не проводят.

       Отбор и   приготовление   проб   лекарственных   средств   для

   испытаний.  От каждой серии лекарственного средства (независимо от

   ее объема) отбирают среднюю пробу не менее 50 г (мл), состоящую из

   равных разовых проб,  взятых из минимум 10  разных  упаковок.  Для

   одного   анализа   лекарственного  средства  используют  отдельные

   образцы по 10 г (мл)  для  каждого  из  описанных  далее  разделов

   исследования.  Всего для проведения одного анализа используют 30 г

   (мл)  лекарственного  средства.  В  том  случае,  когда  возникает

   необходимость   подтвердить  несомненность  результатов,  проводят

   повторное  испытание  только  по  данному  разделу   исследования,

   используя образец в количестве 10 г (мл).

       Для ряда   лекарственных   средств    (антибиотиков,    мягких

   лекарственных  форм  и др.) отбирают от каждой серии среднюю пробу

   не менее 15 г,  состоящую из равных разовых  проб,  взятых  из  не

   менее  чем  10  разных  упаковок.  Для  одного  анализа используют

   образцы по 3 г (мл) для каждого раздела  исследования.  Всего  для

   проведения  одного  анализа  используют по 9 г (мл) лекарственного

   средства.  При  повторении  испытания  по   одному   из   разделов

   исследования используют образец в количестве 3 г (мл).

       Для лекарственных  средств  в  аэрозольной  упаковке,   пленок

   полимерных лекарственных и др. отбор и приготовление проб проводят

   согласно указанию в частных статьях.

       В зависимости   от   физических  свойств  лекарственной  формы

   образец  для  анализа  готовят  в  виде  раствора,  суспензии  или

   эмульсии:

       - твердые лекарственные формы,  которые  трудно  растворяются,

   измельчают  с помощью соответствующего оборудования и суспендируют

   в фосфатном буферном растворе рН 7,0  или  соответствующей  жидкой

   питательной   среде,   рекомендованной   для   определенного  вида

   испытания;

       - жидкие лекарственные формы,  а также твердые формы,  которые

   быстро и практически полностью растворяются в  фосфатном  буферном

   растворе рН 7,0 или соответствующей питательной среде в разведении

   1:10, готовят в виде растворов или суспензий;

       - мягкие    лекарственные   формы,   нерастворимые   в   воде,

   эмульгируют  в  фосфатном  буферном  растворе  рН  7,0  с  помощью

   стеклянных  бус  и минимального количества подходящего стерильного

   эмульгатора,  указанного  в  соответствующей   статье   (например,

   твин-80),  применяя  механическое  встряхивание  и  нагревание  до

   температуры не более 45 град. С в случае необходимости.

       Приготовленные разведения  образцов используют для определения

   общего числа бактерий и грибов в 1 г (мл) лекарственного  средства

   и установления  отсутствия  бактерий  семейств Enterobacteriaceae,

   Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

               Количественное определение микроорганизмов

       Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри

   диаметром 90-100 мм.  Образец лекарственного средства в количестве

   10 г (мл) растворяют,  суспендируют или  эмульгируют  в  фосфатном

   буферном  растворе  рН  7,0  так,  чтобы  конечный  объем раствора

   (суспензии, эмульсии) был 100 мл. Посевы просматривают ежедневно.

       Определение общего   числа  бактерий.  Приготовленный  раствор

   (суспензию,  эмульсию) образца вносят по 1 мл  в  каждую  из  двух

   пробирок  с  4 мл расплавленной и охлажденной до температуры от 45

   до 50 град. С среды N 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и

   переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной

   среды  N  1.   Быстрым   покачиванием   чашки   Петри   равномерно

   распределяют  верхний  слой  агара.  После  застывания среды чашки

   переворачивают и инкубируют в течение 5 сут при температуре от  30

   до 35 град.  С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают

   число  бактериальных  колоний  на  двух  чашках,  находят  среднее

   значение и,  умножая его на показатель разведения, вычисляют число

   бактерий в 1 г (мл) образца.

       Для получения  достоверных  результатов  учитывают  только  те

   чашки, на  которых  выросло  от  30  до  300  колоний.  Если   при

   разведении  образца 1:10 нет роста,  результаты отмечают следующим

   образом:  "В 1 г (мл) лекарственного  средства  (сырья)  менее  10

   бактерий".

       Если число  колоний  на  чашке  превышает  300,   делают   ряд

   дальнейших последовательных  разведений  образца (1:100,  1:1000 и

   т.д.),  выбирая для посева  разведение,  наиболее  соответствующее

   указанному выше уровню.

       Определение общего   числа    грибов.    Испытание    проводят

   двухслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду N 2.

   Посевы инкубируют в течение 5 сут при  температуре  от  20  до  25

   град.  С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут подсчитывают общее

   число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят

   среднее значение и,  умножая его на показатель разведения, т.е. на

   10,  вычисляют число грибов в 1 г (мл)  образца.  В  случае,  если

   число колоний грибов на чашке превышает 300, делают ряд дальнейших

   разведений образца.  На чашке учитывают все колонии  грибов,  даже

   если их число менее 30.

                       ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ

                      СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE

       Образец в количестве 10 г (мл) вносят  в  100  мл  питательной

   среды  N 3,  перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до 35

   град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей

   на среды N 4 и N 5,  разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при

   температуре от 30 до 35 град.  С в течение  24-48  ч.  Если  после

   инкубации  на  средах N 4 и N 5 не будет колоний,  соответствующих

   морфологической характеристике,  данной в табл. 14, считают, что в

   образце нет бактерий семейства Enterobacteriaceae.

       Колонии, подозрительные  по  морфологии  на  принадлежность  к

   семейству Enterobacteriaceae, пересевают каждую отдельно со сред N

   4 и N 5 на скошенную в  пробирках  среду  N  1  и  выращивают  при

   температуре  от  30  до  35 град.  С в течение 18-20 ч.  Из каждой

   пробирки с чистой культурой через сутки делают пересевы на среды N

   6 и N 7.  После посева в половину пробирок со средой N 6 вносят по

   0,5 мл стерильного вазелинового масла.  Все посевы инкубируют  при

   температуре  от  30 до 35 град.  С в течение 18-20 ч.  При наличии

   роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды N

   6 из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.  О наличии

   нитритов в среде N 7 судят по появлению красного  окрашивания  при

   внесении  в  среду  реактива Грисса.  Параллельно исследуют чистые

   культуры на наличие фермента цитохромоксидазы.

       Если в  образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие

   палочки,   которые   дают   отрицательную   оксидазную    реакцию,

   ферментируют глюкозу с образованием кислоты (или кислоты и газа) и

   восстанавливают  нитраты   в   нитриты,   лекарственное   средство

   контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae.

                                                           Таблица 14

                Морфологическая характеристика бактерий

                      семейства Enterobacteriaceae

                       на диагностических средах

   ------------------------------------------------------------------

   | Диагностическая  |           N 4            |       N 5        |

   |      среда       |        агар Эндо         |висмутсульфит агар|

   |------------------+--------------------------+------------------|

   |Характерная       |Колонии круглые, малиновые|Черные колонии   с|

   |морфология колоний|с  металлическим   блеском|характерным метал-|

   |                  |или  без  него;   розовые,|лическим  блеском,|

   |                  |бесцветные,     блестящие,|участки среды  под|

   |                  |выпуклые диаметром 2-4 мм |колониями окрашены|

   |                  |                          |в черный цвет;    |

   |                  |                          |зеленовато - бурые|

   |                  |                          |колонии,  светло -|

   |                  |                          |зеленые, бурые    |

   |Окраска по Граму  |Грамотрицательные неспорообразующие палочки  |

   ------------------------------------------------------------------

                       ВЫЯВЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ

             PSEUDOMONAS AERUGINOSA И STAPHYLOCOCCUS AUREUS

       Образец в  количестве  10  г  (мл) вносят в 100 мл питательной

   среды N 8,  перемешивают и инкубируют при температуре от 30 до  35

   град. С в течение 24-48 ч. При наличии роста делают пересев петлей

   на среды N 9 и N 10, разлитые в чашки Петри. Посевы инкубируют при

   температуре от 30 до 35 град. С в течение 24-48 ч.

       Если после инкубации на средах  N  9  и  N  10  не  обнаружены

   колонии     микроорганизмов,    соответствующих    морфологической

   характеристике,  данной  в  табл.  15  и  16,   считают,   что   в

   лекарственном средстве нет Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus

   aureus.  При наличии на среде  N  9  характерных  для  Pseudomonas

   aeruginosa  колоний  грамотрицательных  неспорообразующих палочек,

   обладающих специфическим  запахом  и  выделяющих  сине  -  зеленый

   пигмент  пиоцианин  в  питательный  агар,  культуру  исследуют  на

   наличие фермента цитохромоксидазы.

                                                           Таблица 15

               Морфологическая характеристика Pseudomonas

                aeruginosa на диагностической среде N 9

   ------------------------------------------------------------------

   |  Характерная морфология  |          Окраска по Граму           |

   |         колоний          |                                     |

   |--------------------------+-------------------------------------|

   |Зеленоватые, как  правило,|Грамотрицательные   неспорообразующие|

   |флюоресцирующие   колонии,|палочки                              |

   |голубые в ультрафиолетовом|                                     |

   |свете                     |                                     |

   ------------------------------------------------------------------

                                                           Таблица 16

             Морфологическая характеристика Staphylococcus

                  aureus на диагностической среде N 10

   ------------------------------------------------------------------

   |Характерная морфология|           Окраска по Граму              |

   |      колоний         |                                         |

   |----------------------+-----------------------------------------|

   |Золотисто - желтые ко-|Грамположительные  кокки,   расположенные|

   |лонии, окруженные жел-|гроздьями                                |

   |тыми зонами           |                                         |

   ------------------------------------------------------------------

       Если в  образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие

   палочки,  которые дают положительную оксидазную реакцию и образуют

   сине  -  зеленый  пигмент,  лекарственное средство контаминировано

   Pseudomonas aeruginosa.

       Наличие на   среде   N   10   золотисто   -   желтых   колоний

   грамположительных кокков,     окруженных      желтыми      зонами,

   свидетельствует    о    ферментации   маннита.   Чистую   культуру

   стафилококка исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

       Если в  образце  обнаружены  грамположительные кокки,  которые

   ферментируют маннит и дают положительную реакцию плазмокоагуляции,

   лекарственное средство контаминировано Staphylococcus aureus.

       В нестерильных лекарственных средствах не допускается  наличие

   бактерий семейства  Enterobacteriaceae,  Pseudomonas  aeruginosa и

   Staphylococcus aureus.

       В 1   г   (мл)   лекарственного  средства  для  приема  внутрь

   допускается наличие не более  1000  бактерий  и  100  дрожжевых  и

   плесневых грибов (суммарно).

       В 1 г (мл) лекарственного средства для  применения  в  полости

   уха,  носа,  для  интравагинального  использования  и для местного

   употребления допускается наличие не более 100  микроорганизмов,  в

   том числе и грибов.

       Тест на наличие  нитритов.  К  суточной  исследуемой  культуре

   бактерий  на  среде  N  7  приливают  0,2-0,3  мл реактива Грисса,

   погружая пипетку до дна пробирки.  Появление красного  окрашивания

   свидетельствует о наличии нитритов.

       Тест на  наличие  цитохромоксидазы.   Полоску   фильтровальной

   бумаги   смачивают  реактивом  и  наносят  платиновой  петлей  или

   стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых  бактерий

   со скошенной среды N 1.  Синее окрашивание, появляющееся через 2-5

   мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.

       Тест на  наличие  плазмокоагулазы  (реакция плазмокоагуляции).

   Кровь, взятую стерильным шприцем из сердца кролика, помещают в  5%

   стерильный раствор натрия цитрата, отсасывают плазму, разводят 1:5

   0,9% стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают

   по  0,5  мл  в  стерильные пробирки.  В каждую пробирку помещают 1

   петлю суточной культуры стафилококка и инкубируют при  температуре

   от 30 до 35 град.  С в течение 4-6 ч. Если в течение этого времени

   не наблюдают свертывание плазмы,  реакцию плазмокоагуляции считают

   отрицательной.  Обязательно  наличие  двух контролей:  1) контроль

   раствора плазмы,  2) контроль культуры  стафилококка,  обладающего

   ферментом коагулазой.

       Для удобства   постановки   реакции   плазмокоагуляции   можно

   использовать   сухую   кроличью   цитратную  плазму  промышленного

   производства, которую разводят согласно наставлению по применению.

                           Питательные среды

       Питательные среды  должны   обеспечивать   рост   и   развитие

   определенных микроорганизмов.  Готовить питательные среды следует,

   строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компоненты питательных

   сред должны соответствовать ГОСТ и ТУ.

       Состав и приготовление питательных  сред.  Среда  N  1  -  для

   выращивания бактерий:

               пептона ферментативного сухого        10 г

               натрия хлорида                         5 >>

               глюкозы                                1 >>

               агара микробиологического <*>         13 >>

               мясной воды (1:2)                   1000 мл

       рН после стерилизации 7,3 +/-0,2.

       К мясной воде прибавляют пептон и  натрия  хлорид,  растворяют

   при  нагревании,  вносят  глюкозу,  устанавливают  рН,  кипятят  в

   течение 1 мин,  прибавляют замоченный заранее агар,  нагревают  до

   полного его расплавления, фильтруют через ватно - марлевый фильтр.

   Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением

   при температуре 121 град. С в течение 15 мин.

       Среда N 2 - для выращивания грибов (Сабуро):

               пептона ферментативного сухого       10 г

               глюкозы                              40 >>

               агара микробиологического <*>        13 >>

               воды дистиллированной              1000 мл

       рН после стерилизации 5,6 +/-0,2.

       Все ингредиенты  растворяют  в  воде,  прибавляют   замоченный

   заранее  агар,  нагревают  до полного его расплавления,  фильтруют

   через ватно - марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе

   насыщенным паром  под  давлением  при  температуре  121 град.  С в

   течение 15 мин.  Для подавления роста бактерий после  стерилизации

   насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бензилпенициллина

   и 100 мг тетрациклина (либо перед стерилизацией  насыщенным  паром

   под давлением - 50 мг левомицетина) на 1000 мл среды.

       --------------------------------

       <*> Жидкие среды N 1 и N 2 не содержат агара.

       Среда N  3  -  среда   обогащения   для   бактерий   семейства

   Enterobacteriaceae:

             пептона ферментативного сухого       10,0   г

             натрия фосфата двузамещенного         7,5   >>

             калия фосфата однозамещенного         2,5   >>

             глюкозы                              10,0   >>

             фенолового красного                   0,08  >>

             малахитового зеленого                 0,015 >>

             мясной воды (1:2)                  1000     мл

       рН после стерилизации 7,3 +/-0,2.

       Пептон и соли растворяют в мясной воде при нагревании,  вносят

   глюкозу,  прибавляют 8 мл  1%  раствора фенолового красного и 3 мл

   0,5% раствора малахитового зеленого,  устанавливают рН,  кипятят 1

   мин, фильтруют через бумажный фильтр. Стерилизуют насыщенным паром

   под давлением при температуре 121 град.  С  в  течение  15  мин  в

   паровом стерилизаторе.

       Среда N 4 (агар Эндо сухой) -для выделения  прописи  семейства

   Enterobacteriaceae - готовят согласно бактерий на этикетке.

       Среда N  5 (висмутсульфит агар сухой) - для выделения бактерий

   семейства  Enterobacteriaceae  -  готовят  согласно   прописи   на

   этикетке.

       Среда N 6 - для определения ферментации глюкозы:

             пептона ферментативного сухого       10,0  г

             натрия хлорида                       5,0   >>

             глюкозы                              40,0  >>

             фенолового красного                  0,08  >>

             мясной воды (1:2)                    1000  мл

       рН после стерилизации 7,2 +/-0,2.

       Пептон и  натрия  хлорид  растворяют   в   мясной   воде   при

   нагревании,   вносят   глюкозу,  прибавляют  8   мл   1%  раствора

   фенолового красного,  устанавливают рН,  кипятят 1 мин,  фильтруют

   через  бумажный  фильтр и разливают в пробирки с поплавками по 4-5

   мл.  Стерилизуют в  паровом  стерилизаторе  насыщенным  паром  под

   давлением при  температуре  121  град.  С  в  течение  15 мин.  По

   окончании стерилизации следует как можно быстрее охладить среду.

       Среда N 7 - для определения восстановления нитратов в нитриты:

              пептона ферментативного сухого       5,0 г

              натрия хлорида                       5,0 >>

              калия нитрата                        1,5 >>

              воды дистиллированной             1000   мл

       рН после стерилизации 7,2 +/-0,2.

       Все компоненты растворяют в воде при нагревании, устанавливают

   рН,  кипятят 1 мин,  фильтруют через бумажный фильтр,  разливают в

   пробирки по 4-5 мл. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным

   паром под давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин.

                                                           Таблица 17

           Тест - микроорганизмы и условия для биологического

                  определения активности антибиотиков

   ------------------------------------------------------------------------------

   |              |               |  Среда для     |Количество|                 |

   |              |               |  определения   | среды на |                 |

   |              |               |  активности    |  каждую  |                 |

   |Антибиотик <1>|Тест - микро-  |    <3, 4>      |  чашку,  |    Посевная     |

   |              |организмы <2>  |                | мл <5>   |    доза <6>     |

   |              |               |----------------+----------|                 |

   |              |               |ниж-|  верхний  |ниж-|верх-|                 |

   |              |               |ний |    лой    |ний | ний |                 |

   |              |               |слой|           |слой|слой |                 |

   |--------------+---------------+----+-----------+----+-----+-----------------|

   |Ампициллин    |Staphylococcus |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн  микробных|

   |              |aureus 209 Р   |    |глюкозы    |    |     |клеток  на  1  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Амфотерицин В |Candida utilis |    |N 16 + 0,1%|    |  15 |3   мл    рабочей|

   |              |ЛИА-01         |    |глюкозы    |    |     |взвеси на 100  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Бензилпеницил-|Staphylococcus |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн  микробных|

   |лин           |aureus 209 Р   |    |глюкозы    |    |     |клеток  на  1  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Гелиомицин    |Вас. subtilis  |N 17|   N 17    |    | 15  |100 млн спор на 1|

   |              |ATCC 6633      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Гентамицин    |Вас. pumilus   |    |   N 9     | 20 |  5  |50 млн спор на  1|

   |              |NCTC 8241      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Грамицидин С  |Вас.cereus     |    |   N 13    |    | 10  |8 млн спор на   1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |537            |    |           |    |     |                 |

   |Дактиномицин  |Вас. cereus,   |    |   N 14    |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |HB             |    |           |    |     |                 |

   |Дигидростреп- |Вас. cereus,   |    |   N 9     |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |томицин       |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |537            |    |           |    |     |                 |

   |Диклоксациллин|Staphylococcus |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн  микробных|

   |              |aureus         |    |глюкозы    |    |     |клеток  на  1  мл|

   |              |209 P          |    |           |    |     |среды            |

   |Доксициклин   |Вас. subtilis, |    |N 6 + 1%   |    | 10  |30 млн спор на  1|

   |              |var Л2         |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Канамицин В10 |Вас. subtilis  |N 12|   N 8     | 10 |  5  |100 млн спор на 1|

   |              |ATCC 6633      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Канамицин     |Вас. pumilus   |N 8 |   N 8     | 15 |  5  |40 млн спор на  1|

   |              |NCTC 8241      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Карбенициллин |Pseudomonas    |    |   N 7     |    | 15  |10  мл  бульонной|

   |              |aeruginosa     |    |           |    |     |культуры  на  100|

   |              |NCTC 2134      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Карминомицин  |Вас. cereus,   |    |   N 5     |    | 15  |100 млн спор на 1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |537            |    |           |    |     |                 |

   |Леворин       |Candida utilis |    |N 16 + 1%  |    | 15  |2-2,5 мл  рабочей|

   |              |ЛИА-01         |    |глюкозы    |    |     |взвеси на 100  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Линкомицин    |Вас. subtilis  |    |   N 8     |    | 10  |100 млн спор на 1|

   |              |ATCC 6633      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Метациклин    |Вас. subtilis, |    |N 6 + 1%   |    | 10  |30 млн спор на  1|

   |              |var. Л2        |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Метициллин    |Staphylococcus |    |N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн  микробных|

   |              |N 11 aureus    |    |глюкозы    |    |     |клеток  на  1  мл|

   |              |209 P          |    |           |    |     |среды            |

   |Микогептин    |Candida utilis |    |N 16 + 1%  |    | 15  |2,5-3 мл  рабочей|

   |              |ЛИА-01         |    |глюкозы    |    |     |взвеси на 100 мл |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Мономицин     |Вас. cereus,   |    |   N 9     |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |537            |    |           |    |     |                 |

   |Неомицин      |То же          |N 9 |           | 20 |  5  |20 млн спор на  1|

   |              |               |    |           |    |     |мл среды         |

   |Нистатин      |Candida utilis |    |N 16 + 1%  |    | 15  |3-3,5 мл  рабочей|

   |              |ЛИА-01         |    |глюкозы    |    |     |взвеси на 100  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Оксациллин    |Staphylococcus |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн  микробных|

   |              |aureus 209 Р   |    |глюкозы    |    |     |клеток  на  1  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Окситетра-    |Вас. subtilis  |    |N 6 + 1%   |    | 10  |30 млн спор на  1|

   |циклин        |var. Л2        |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Олеандомицин  |Вас. cereus,   |    |   N 9     |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |HB             |    |           |    |     |                 |

   |Оливомицин    |Вас. subtilis  |N 11|   N 18    | 10 |  5  |10 млн спор на  1|

   |              |АТСС 6633      |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Полимиксин В  |Bordetella     |    |   N 15    |    | 10  |40-60 млн микроб-|

   |              |bronchiseptica |    |           |    |     |ных клеток  на  1|

   |              |АТСС 4617      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Полимиксин М  |Bordetella     |    |   N 15    |    | 10  |40-60 млн микроб-|

   |              |bronchiseptica |    |           |    |     |ных клеток на   1|

   |              |АТСС 4617      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Рифампицин    |Вас. subtilis  |    |N 10 + 0,1%|    | 10  |40 млн спор на  1|

   |              |АТСС 6633      |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Рубомицин     |Вас. cereus,   |    |   N 5     |    | 15  |10 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |537            |    |           |    |     |                 |

   |Сизомицин     |Вас. pumilus   |N 12|   N 8     | 20 |  5  |50 млн спор на  1|

   |              |NCTC 8241      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Стрептомицин  |Вас. cereus,   |    |   N 9     |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |537            |    |           |    |     |                 |

   |Тетрациклин   |Вас. subtilis  |    |N 6 + 1%   |    | 10  |30 млн спор на  1|

   |              |var Л2         |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Феноксиметил- |Staphylococcus |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн  микробных|

   |пенициллин    |aureus 209 P   |    |глюкозы    |    |     |клеток  на  1  мл|

   |              |               |    |           |    |     |среды            |

   |Флоримицин    |Вас. subtilis  |    |   N 8     |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |              |ATCC 6633      |    |           |    |     |мл среды         |

   |Фузидин       |Вас. cereus,   |    |N 10 + 1%  |    | 10  |50 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |HB             |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Цефалексин    |Вас. subtilis  |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |100 млн спор на 1|

   |              |ATCC 6633      |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |Цефалотин     |Вас. subtilis  |N 11|N 7 + 0,1% | 10 |  5  |40 млн спор на  1|

   |              |ATCC 6633      |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |Хлортетраци-  |Вас. subtilis, |    |N 6 + 1%   |    | 10  |30 млн спор на  1|

   |клин          |var Л2         |    |глюкозы    |    |     |мл среды         |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |Эритромицин   |Вас. cereus,   |    |   N 9     |    | 10  |20 млн спор на  1|

   |              |var. mycoides  |    |           |    |     |мл среды         |

   |              |HB             |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   |              |               |    |           |    |     |                 |

   ------------------------------------------------------------------------------

       Продолжение таблицы

   ----------------------------------------------------------------------------------

   |                |Растворитель для приготовления  | Срок годности | Контрольная  |

   |                |    растворов стандартного и    |   основного   | концентрация |

   |                |      испытуемого образцов      |   раствора    |   раствора   |

   |  Стандартный   |--------------------------------| стандартного  | стандартного |

   |    образец     |основной раствор|рабочий раствор|  образца при  |образца <7, 8>|

   |                |                |               |температуре от |в мкг/мл акт. |

   |                |                |               |4 до 10 град.С,| вещества или |

   |                |                |               |      сут      |    ЕД/ мл    |

   |                |                |               |               |              |

   |----------------+----------------+---------------+---------------+--------------|

   |Ампициллина     |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       3       |  1 мкг/мл    |

   |тригидрат       |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Амфотерицин В   |Диметилсульфок- |Буфер N 1<11>  |       1       |  0,5 мкг/мл  |

   |                |сид             |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Бензилпеницил-  |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       3       |  1 ЕД/мл     |

   |лина натриевая  |                |               |               |              |

   |соль            |                |               |               |              |

   |Гелиомицин      |0,1 н.   раствор|0,1 н.  раствор|      10       |  4 мкг/мл    |

   |                |едкого натра<13>|едкого натра   |               |              |

   |Гентамицина     |Буфер N 4       |Буфер N 4      |      14       |  2 мкг/мл    |

   |сульфат         |                |               |               |              |

   |Грамицидин С    |Этиловый        |Дистиллирован- |      30       |100 мкг/мл    |

   |                |спирт 95%       |ная вода       |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Дактиномицин    |Дистиллированная|Буфер N 4      |      15       |  4 мкг/мл    |

   |                |вода <9>        |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Дигидрострепто- |Буфер N 3       |Буфер N 4      |      30       |  2 мкг/мл    |

   |мицина сульфат  |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Диклоксациллина |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       6       |  8 мкг/мл    |

   |натриевая соль  |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Доксициклина    |0,01 н.  раствор|Буфер N 2      |       7       |  0,5 мкг/мл  |

   |гидрохлорид     |хлористоводо-   |               |               |              |

   |                |родной кислоты  |               |               |              |

   |Канамицина      |Дистиллированная|Буфер N 4      |      30       |  1 мкг/мл    |

   |моносульфат     |вода            |               |               |              |

   |Канамицина      |Дистиллированная|Буфер N 4      |      30       | 10 мкг/мл    |

   |моносульфат     |вода            |               |               |              |

   |Карбенициллина  |Буфер N 1       |Буфер N 2      |       3       | 10 мкг/мл    |

   |динатриевая     |                |               |               |              |

   |соль            |                |               |               |              |

   |Карминомицина   |Дистиллированная|Буфер N 4      |      10       | 15 мкг/мл    |

   |гидрохлорид     |вода            |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Леворин         |Диметилсульфок- |Диметилсульфок-|     3(10)     |  0,5 мкг/мл  |

   |                |сид             |сид до концен- |               |              |

   |                |                |трации 100 мкг |               |              |

   |Линкомицина     |Дистиллированная|Буфер N 4      |      30       |100 мкг/мл    |

   |гидрохлорид     |вода            |               |               |              |

   |Метациклина     |0,01 н. раствор |Буфер N 2      |       7       |  0,5 мкг/мл  |

   |гидрохлорид     |хлористоводород-|               |               |              |

   |                |ной кислоты     |               |               |              |

   |Метициллина     |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       3       | 20 мкг/мл    |

   |натриевая       |                |               |               |              |

   |соль            |                |               |               |              |

   |Микогептин      |Диметилсульфок- |Диметилсульфок-|      3 <12>   |  1 мкг/мл    |

   |                |сид             |сид до  концен-|               |              |

   |                |                |трации 50  мкг/|               |              |

   |                |                |мл, а затем бу-|               |              |

   |                |                |фер N 4 <11>   |               |              |

   |Мономицин       |Дистиллированная|3% раствор     |      30       |  2 мкг/мл    |

   |                |вода            |хлорида калия  |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Неомицина       |Буфер N 4       |Буфер N 4      |      30       |  4 мкг/мл    |

   |сульфат         |                |               |               |              |

   |Нистатин        |Диметилформамид |Буфер N 3      |       3       | 20 ЕД/мл     |

   |                |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Оксациллина     |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       3       |  4 мкг/мл    |

   |натриевая соль  |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Окситетрацикли- |0,01 н.  раствор|Буфер N 2      |       7       |  1 мкг/мл    |

   |на гидрохлорид  |хлористоводород-|               |               |              |

   |                |ной кислоты     |               |               |              |

   |Олеандомицина   |Буфер N 3       |Буфер N 4      |       7       |  4 мкг/мл    |

   |фосфат          |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Оливомицин-     |Стандартный     |Буфер N 1      |      14       |  2 мкг/мл    |

   |кислота         |образец в этило-|               |               |              |

   |                |вом спирте    из|               |               |              |

   |                |расчета 5 мг в 1|               |               |              |

   |                |мл, затем  буфер|               |               |              |

   |                |N 1,  испытуемый|               |               |              |

   |                |образец в дисти-|               |               |              |

   |                |ллированной воде|               |               |              |

   |Полимиксин В    |Буфер N 3       |Буфер N 5      |      14       |100 ЕД/мл     |

   |сульфат         |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Полимиксин М    |Буфер N 3       |Буфер N 5      |      14       |100 ЕД/мл     |

   |сульфат         |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Рифампицин      |1 мл диметилфор-|Буфер N 3      |       4       |  5 мкг/мл    |

   |                |мамида на  10 мг|               |               |              |

   |                |навески,   затем|               |               |              |

   |                |дистиллированная|               |               |              |

   |                |вода            |               |               |              |

   |Рубомицина      |Дистиллированная|Буфер N 4      |      10       | 20 мкг/мл    |

   |гидрохлорид     |вода            |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Сизомицина      |Буфер N 4       |Буфер N 4      |      14       |  2 мкг/мл    |

   |сульфат         |                |               |               |              |

   |Стрептомицина   |Буфер N 3       |Буфер N 4      |      30       |  2 мкг/мл    |

   |сульфат         |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Тетрациклина    |0,01 н.  раствор|Буфер N 2      |       7       |  2 мкг/мл    |

   |гидрохлорид     |хлористоводород-|               |               |              |

   |                |ной кислоты     |               |               |              |

   |Феноксиметилпе- |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       7       |  1 ЕД/мл     |

   |нициллин        |                |               |               |              |

   |                |                |               |               |              |

   |Флоримицина     |Дистиллированная|Буфер N 4      |       7       | 10 мкг/мл    |

   |сульфат         |вода            |               |               |              |

   |Фузидиевая      |Стандартный     |Буфер N 3      |       7       |  5 мкг/мл    |

   |кислота         |образец - в эти-|               |               |              |

   |                |ловом спирте  из|               |               |              |

   |                |расчета 10 мг/мл|               |               |              |

   |                |затем буфер N 4;|               |               |              |

   |                |испытуемый обра-|               |               |              |

   |                |зец - в   буфере|               |               |              |

   |                |N 4             |               |               |              |

   |Цефалексин      |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       3       |  5 мкг/мл    |

   |                |                |               |               |              |

   |Цефалотина нат- |Буфер N 1       |Буфер N 1      |       3       |  0,5 мкг/мл  |

   |риевая соль     |                |               |               |              |

   |Хлортетрацикли- |0,01 н.  раствор|Буфер N 2      |       7       |  1 мкг/мл    |

   |на гидрохлорид  |хлористоводород-|               |               |              |

   |                |ной кислоты     |               |               |              |

   |Эритромицин     |1  мл  этилового|Буфер N 4      |       7       |  2 мкг/мл    |

   |                |спирта на 10 мг |               |               |              |

   |                |навески,   затем|               |               |              |

   |                |буфер  N 4    до|               |               |              |

   |                |1000 ЕД/мл      |               |               |              |

   ----------------------------------------------------------------------------------

       --------------------------------

       <1> Условия определения антимикробной активности  антибиотиков

   указанных  наименований  распространяются  и  на  их лекарственные

   формы.

       <2> ATCC  -  Американская  типовая  коллекция культур,  NCTC -

   Национальная коллекция типовых культур.

       <3> Состав,  приготовление сред и буферных смесей см. табл. 19

   и 20.

       <4> Глюкозу  добавляют  в  расплавленный  агар   в  виде   40%

   стерильного раствора.

       <5> Объемы  сред  указаны  для чашек размером 20 х 100 мм. При

   использовании лунок количество среды для нижнего или  одного  слоя

   удваивается.

       <6> Допускается  уменьшение  или  увеличение   посевной   дозы

   тест -  микроба  в  зависимости  от плотности получаемого газона и

   четкости очертания зон.

       <7> В   таблице   указана  контрольная  концентрация  раствора

   стандартного  образца  для  метода  с  использованием  стандартной

   кривой.

       <8> Допускается при необходимости  уменьшение  или  увеличение

   контрольной концентрации раствора стандартного образца.

       <9> Для  полного  растворения  препарата  раствор  помещают  в

   холодильник при температуре от 4 до 10 град. С.

       <10> Активность канамицина В определяется после  гидролиза  по

   стандартному образцу канамицина А.

       <11> Срок годности рабочих растворов в  буфере  при  комнатной

   температуре не более 30 мин.

       <12> Срок годности  основного  раствора  стандартного  образца

   микогептина при комнатной температуре не более 4-5 ч.

       <13> Основной раствор готовят в  концентрации  1  мг  в  5  мл

   раствора натра едкого (0,1 моль/л).

       Среда N   8   -   для  выращивания  Pseudomonas  aeruginosa  и

   Staphylococcus aureus:

               пептона ферментативного сухого     10,0 г

               натрия хлорида                      5,0 >>

               калия фосфата двузамещенного        2,5 >>

               глюкозы                             2,5 >>

               воды дистиллированной            1000   мл

       рН после стерилизации 7,3 +/-0,2.

       Пептон и   соли  растворяют  в  воде  при  нагревании,  вносят

   глюкозу, устанавливают рН, кипятят 1 мин, фильтруют через бумажный

   фильтр.  Стерилизуют  в паровом стерилизаторе насыщенным паром под

   давлением при температуре 121 град. С в течение 15 мин.

       Среда N 9 - для выявления пигмента пиоцианина:

               пептона ферментативного сухого      20,0 г

               магния хлорида безводного            1,4 >>

               калия сульфата безводного           10,0 >>

               глицерина                           10,0 мл

               агара микробиологического           15,0 г

               воды дистиллированной             1000   мл

       рН после стерилизации 7,2 +/-0,2.

       Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде и оставляют

   на  15  мин.  Затем  вносят  глицерин,   тщательно   перемешивают,

   растворяют  при  нагревании,  устанавливают  рН,  кипятят  1  мин,

   прибавляют замоченный  заранее  агар,  нагревают  до  полного  его

   расплавления, фильтруют через ватно - марлевый фильтр. Стерилизуют

   в   паровом  стерилизаторе  насыщенным  паром  под  давлением  при

   температуре 121 град. С в течение 15 мин.

       Среда N 10 - для идентификации Staphylococcus aureus:

             пептона ферментативного сухого      10,0   г

             натрия хлорида                      75,0   >>

             маннита                             10,0   >>

             фенолового красного                  0,025 >>

             агара микробиологического           15,0   >>

             воды дистиллированной             1000     мл

       рН после стерилизации 7,4 +/-0,2.

       Все компоненты растворяют в воде,  вносят 2,5 мл  1%  раствора

   фенолового красного,  устанавливают рН,  кипятят 1 мин, прибавляют

   замоченный  заранее  агар,  нагревают до полного его расплавления,

   фильтруют через  ватно  -  марлевый фильтр.  Стерилизуют в паровом

   стерилизаторе насыщенным паром под давлением при  температуре  121

   град. С в течение 15 мин.

       Требования к ростовым свойствам питательных сред. Используемые

   питательные  среды  должны   обеспечивать   рост   соответствующих

   тест - штаммов бактерий и грибов, указанных в табл. 17, при посеве

   их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток:  для сред N 1, 3,

   6 - 10 не позднее 48 ч инкубации при температуре от 30 до 35 град.

   С и для среды N 2 - не позднее 72 ч инкубации при  температуре  от

   20 до 25 град. С.

                           Растворы, реактивы

       Фосфатный буферный  раствор с натрия хлоридом и пептоном (1/15

   мол):

             рН                                      7,0

             калия фосфата однозамещенного           3,56 г

             натрия фосфата двузамещенного           7,23 >>

             натрия хлорида                          4,3  >>

             пептона ферментативного сухого          1,0  >>

             воды дистиллированной              до 1000   мл

       Стерилизуют в   паровом  стерилизаторе  насыщенным  паром  под

   давлением при температуре 121 град.  С в течение 15  мин.  Раствор

   хранят при температуре от 4 до 10 град. С.

       Феноловый красный - 1% раствор:

           фенолового красного                         1,0 г

           раствора едкого натра 0,1 (моль/л)         28,2 мл

           воды дистиллированной                  до 100   мл

       Навеску индикатора растирают в  ступке,  прибавляя  небольшими

   порциями  едкий натр.  Полученный раствор переносят в мерную колбу

   вместимостью 100 мл и  доводят  объем  раствора  водой  до  метки.

   Хранят   во   флаконе   нейтрального   светозащитного  стекла  при

   температуре от 4 до 10 град. С.

       Малахитовый зеленый - 0,5% раствор:

            малахитового зеленого                      0,5 г

            воды дистиллированной                 до 100 мл

       Навеску красителя переносят в  стеклянный  флакон,  прибавляют

   стерильную   горячую   воду,   помещают   на  сутки  в  термостат,

   периодически встряхивая.

       Реактив Грисса.    Раствор N 1:  0,5  г  сульфаниловой кислоты

   растворяют в 30 мл ледяной уксусной  кислоты,  прибавляют  100  мл

   воды, фильтруют. Раствор годен в течение месяца.

       Раствор N 2:  0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 мл  кипящей

   воды,  охлаждают,  прибавляют  30  мл  ледяной  уксусной  кислоты,

   фильтруют. Раствор годен в течение 7 сут.

       Перед употреблением  смешивают  равные  объемы растворов N 1 и

   N 2.

       Реактив на цитохромоксидазу. Раствор N 1: 1% спиртовой раствор

   нафтола-1.

       Раствор N 2:  1%  раствор N,  N - диметил - р - фенилендиамина

   дигидрохлорида.

       Перед употреблением смешивают растворы N 1 и N 2 в соотношении

   2:3.

       Растворы годны  в  течение 14 сут при хранении при температуре

   от 4 до 10 град. С во флаконах нейтрального светозащитного стекла.

                  ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ

                  АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР

       Определение антимикробной  активности антибиотиков основано на

   их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят

   методом  диффузии  в  агар  на  плотной  питательной  среде  путем

   сравнения размеров   зон   угнетения   роста   тест   -  микробов,

   образующихся при  испытании  растворов  определенных  концентраций

   Государственного стандартного образца <*> и испытуемого препарата.

       --------------------------------

       <*> Далее     "стандартный     образец"     следует     читать

   "Государственный стандартный образец".

       Антимикробная активность  антибиотиков  выражается  в единицах

   действия - ЕД или "мгк".  Для большинства антибиотиков  1  ЕД  или

   "мкг"   соответствуют   1  мкг  активного  вещества  (кислоты  или

   основания);  для   антибиотиков,   имеющих   иное   количественное

   выражение  единицы,  соответствующие  указания  даются  в  частных

   статьях.

       При определении    антимикробной    активности    антибиотиков

   используют стандартные образцы,  активность которых,  как правило,

   устанавливают   в  соответствии  с  Международными  биологическими

   стандартами.  При отсутствии последних для указанных  целей  могут

   быть     использованы    международные    химические    стандарты,

   антимикробную  активность  которых   рассчитывают   на   основании

   показателей качества, установленных физико - химическими методами.

   Антимикробную активность  стандартных  образцов  антибиотиков,  не

   имеющих    аналогов    в   международной   коллекции   стандартов,

   рассчитывают   также   на    основании    показателей    качества,

   установленных физико - химическими методами.

       Стандартные образцы антибиотиков  утверждаются  и  рассылаются

   Государственным научно    -    исследовательским   институтом   по

   стандартизации и контролю лекарственных  средств  Минздрава  СССР,

   хранятся   и   используются   в   соответствии  с  рекомендациями,

   указанными на этикетке стандартного образца.

       Метод определения.  Тест  -  микробы,  растворители,  буферные

   растворы,  питательные среды и прочие условия проведения испытания

   указаны в табл. 18.

       В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на

   столиках   со   строго   горизонтальной   поверхностью,  разливают

   расплавленные питательные среды определенного состава в  один  или

   два  слоя.  Для  нижнего  слоя  используют незасеянные среды,  для

   верхнего  или  одного  слоя  -  агаровую   среду,   предварительно

   засеянную соответствующим   тест   -   микробом.   Если   культура

   представляет собой суспензию вегетативных клеток,  то  температура

   расплавленной среды,  в которую вносят тест - микроб,  должна быть

   (49 +/-1) град.  С, при использовании суспензии спор - 65-70 град.

   С.  К  среде   следует   добавить   такое   количество   суспензии

   вегетативных  клеток  или  спор,  которое обеспечивает оптимальный

   рост тест - микроба и четкость зон угнетения его роста.

                                                           Таблица 18

          Характеристика культуральных свойств тест - микроба

   -----------------------------------------------------------------------------------------------------

   |                |    При росте на плотной      |    При росте на жидкой     |                      |

   |    Название    |     питательной среде        |     питательной среде      | При микроскопическом |

   | тест - микроба |------------------------------+----------------------------|   изучении мазка     |

   |                |  условия  |описание культуры | условия  |описание культуры|  агаровой культуры,  |

   |                |выращивания|                  |выращива- |                 | окрашенной по Граму  |

   |                |           |                  |   ния    |                 |                      |

   |----------------+-----------+------------------+----------+-----------------+----------------------|

   |Staphylococcus  |Среда  N 1,|Гладкие с  ровными|Мясо -    |Равномерное   по-|Однородные по величине|

   |aureus 209 Р    |Т     град.|краями колонии,  с|пептонный |мутнение  бульона|и расположению в виде |

   |                |(36   +/-1)|равномерной  золо-|бульон,   |без пленки и сли-|гроздьев кокки с хоро-|

   |                |град.    С,|тистой   пигмента-|рН 7,2-7,4|зистого осадка на|шо выраженной  грампо-|

   |                |18 - 20  ч |цией              |18-20 ч   |дне              |ложительной окраской  |

   |                |затем   при|                  |          |                 |                      |

   |                |комнатной  |                  |          |                 |                      |

   |                |температуре|                  |          |                 |                      |

   |Candida utilis  |Среда  N 3,|Круглые, кремового|МПБ,      |Рост в виде  рав-|Овальные, иногда с от-|

   |ЛИА-01          |Т     град.|цвета  с   матовой|рН 7,2-7,4|номерной  мути  и|ростками клетки;  рас-|

   |                |(30   +/-1)|поверхностью коло-|с 1%      |осадка на дне    |положены отдельно, це-|

   |                |град.    С,|нии   с    ровными|глюкозой, |                 |почками или группами  |

   |                |48 ч,      |краями            |18-20 ч   |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |Bacillus subti -|Среда  N 1,|Колонии желтовато-|МПБ,      |Рост в виде плен-|Палочки с закругленны-|

   |lis, var. Л2    |Т     град.|го цвета,  круглой|рН 7,2-7,4|ки с осадком   на|ми краями, располагаю-|

   |                |(36   +/-1)|формы, влажно бле-|18-20 ч   |дне              |щиеся отдельно и   це-|

   |                |град.    С,|стящие с  шагрене-|          |                 |почками с хорошо выра-|

   |                |18 - 20  ч,|вой  поверхностью,|          |                 |женной грамположитель-|

   |                |           |слегка зазубренны-|          |                 |ной окраской          |

   |                |           |ми краями  и  при-|          |                 |                      |

   |                |           |поднятым центром  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |Bacillus subti -|Среда  N 1,|Мелкие   сероватые|МПБ,      |Рост в виде плен-|Тонкие палочки, распо-|

   |lis ATCC 6633   |Т     град.|колонии с зубчатым|рН 6,8-7,0|ки с осадком   на|лагающиеся отдельно   |

   |                |(36   +/-1)|краем             |18-20 ч   |дне              |или цепочками, с хоро-|

   |                |град.    С,|                  |          |                 |шо выраженной грампо- |

   |                |18 - 20  ч |                  |          |                 |ложительной окраской  |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |Bacillus cereus,|Среда  N 2,|Шероховатые  коло-|МПБ, рН   |Морщинистая плен-|Палочки с закругленны-|

   |var. mycoides   |Т     град.|нии с краем, сфор-| 7,8-8,0, |ка;  вся    среда|ми концами,   распола-|

   |537             |(36   +/-1)|мированным из  пе-|18-20 ч   |прозрачная    без|гающиеся отдельно или |

   |                |град.    С,|реплетающихся во- |          |осадков          |цепочками, с хорошо   |

   |                |18 - 20  ч |локон             |          |                 |выраженной грамположи-|

   |                |           |                  |          |                 |тельной окраской      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |Bacillus cereus,|Среда  N 1,|Гладкие колонии  с|МПБ, рН   |Равномерное пому-|Тонкие с закругленными|

   |var. mycoides   |Т     град.|ровными краями   и|6,8-7,0,  |тнение    бульона|концами палочки,  рас-|

   |HB              |(36   +/-1)|сферической    по-|18-20 ч   |без образования  |полагающиеся  отдельно|

   |                |град.    С,|верхностью        |          |пленки и осадка  |или короткими цепочка-|

   |                |18 - 20  ч |                  |          |                 |ми, с хорошо  выражен-|

   |                |           |                  |          |                 |ной  грамположительной|

   |                |           |                  |          |                 |окраской              |

   |Bacillus pumi-  |Среда  N 1,|Мелкие  серовато -|МПБ, рН   |Равномерное пому-|Тонкие, мелкие палочки|

   |lus NCTC 8241   |Т     град.|голубого цвета ко-| 7,2-7,4, |тнение    бульона|с закругленными конца-|

   |                |(36   +/-1)|лонии с  зазубрен-|18-20 ч   |без образования  |ми,    располагающиеся|

   |                |град.    С,|ными краями и при-|          |пленки и осадка  |отдельно или короткими|

   |                |18 - 20  ч |поднятым  центром |          |                 |цепочками,   с  хорошо|

   |                |           |                  |          |                 |выраженной грамотрица-|

   |                |           |                  |          |                 |тельной окраской      |

   |Bordetella      |МПА,       |Мелкие,    мутные,|МПБ,      |Заметное помутне-|Одиночные,   короткие,|

   |bronchiseptica  |рН  7,2-7,4|белые, слегка  вы-|рН 7,2-7,4|ние, серая  плен-|тонкие палочки с хоро-|

   |ATCC 4617       |Т     град.|пуклые,   фарфоро-|          |ка, тягучий оса- |шо выраженной    грам-|

   |                |(36   +/-1)|видные колонии    |          |док              |отрицательной окраской|

   |                |град.    С,|                  |          |                 |                      |

   |                |18 - 20  ч,|                  |          |                 |                      |

   |                |           |                  |          |                 |                      |

   |Pseudomonas     |МПБ,       |Широкие,  расплыв-|МПБ,      |Заметное помутне-|Одиночные палочки либо|

   |aeruginosa      |рН  7,2-7,4|чатые,  прозрачные|рН 7,2-7,4|ние,      толстая|короткие цепочки с хо-|

   |NCTC 2134       |Т     град.|с неровным   краем|          |пленка, среда мо-|рошо выраженной  грам-|

   |                |(36   +/-1)|колонии           |          |жет   приобретать|отрицательной окраской|

   |                |град.    С,|                  |          |желтовато - зеле-|                      |

   |                |18 - 20  ч,|                  |          |ную окраску      |                      |

   -----------------------------------------------------------------------------------------------------

       Шесть стерильных  цилиндров  единого размера и массы,  высотой

   (10,0 +/-0,1) мм  и  внутренним  диаметром  (6,0  +/-0,1)  мм,  из

   нержавеющей   стали   или   алюминия  расставляют  на  поверхности

   засеянной среды на равном расстоянии  друг  от  друга  и  от  края

   чашки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диаметром от

   6 до 8 мм,  сделанные в толще агара с помощью  стерильного  сверла

   либо другого соответствующего приспособления.

       В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих

   растворов  стандартного и испытуемого образцов.  Основные растворы

   стандартных   и   испытуемых   образцов   готовят   в   стерильных

   растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов

   в зависимости от применяемого  варианта  метода  диффузии  в  агар

   (трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие

   растворы  трех  или  одной  концентраций  испытуемого  образца   и

   растворы трех или пяти концентраций стандартного образца.

       Рабочие растворы  испытуемых  образцов  готовят  из   основных

   растворов   таким   образом,   чтобы   их  концентрации  не  имели

   существенных  отличий  от   концентраций   раствора   стандартного

   образца.

       Для уменьшения влияния колебаний во времени между закапыванием

   растворов,  используемых в опыте,  рекомендуется после их внесения

   выдерживать чашки при комнатной температуре в течение 1-2 ч. Затем

   чашки инкубируют при температуре (36 +/-1) град. С в течение 16-18

   ч.

       Диаметры зон   угнетения  роста  тест  -  микроба  при  помощи

   соответствующих приборов измеряют с точностью до 0,1 мм.

       Определение антимикробной     активности     антибиотиков    с

   использованием трехдозного варианта метода диффузии  в  агар.  Для

   проведения  испытания  готовят  три  раствора стандартного образца

   (C1,  С2,  С3) и три раствора испытуемого образца  (И1,  И2,  И3).

   Концентрации растворов,  содержащих малую, среднюю и большую дозы,

   должны находиться между собой в кратном соотношении  (1:2:4).  При

   необходимости  это  соотношение может быть изменено.  Концентрация

   раствора С2 должна быть близка контрольной  концентрации  раствора

   стандартного образца, указанной в табл. 17.

       Все растворы стандартного  и  испытуемого  образцов  вносят  в

   цилиндры или лунки одной чашки Петри таким образом, чтобы растворы

   с  большими   концентрациями   не   соприкасались   между   собой.

   Предлагаемый вариант закапывания С1И3С2И1С3И2.

       Число чашек,  используемых  в  каждом   опыте,   должно   быть

   достаточным    для    обеспечения   статистической   достоверности

   результатов, но не менее 6 чашек.

       Последовательность внесения     растворов    стандартного    и

   испытуемого образцов в цилиндры или лунки каждой чашки должна быть

   следующей:   первым   вносят   раствор   с   малой   концентрацией

   стандартного образца (C1) и  соответствующий  раствор  испытуемого

   образца  (И1).  Затем растворы со средней концентрацией (С2 и И2),

   последними вносят растворы с большими концентрациями (С3 и И3).

       Расчет активности  и  дисперсионный  анализ  при использовании

   трехдозного варианта  метода  диффузии  в  агар  осуществляется  в

   соответствии  со  статьей  "Статистическая  обработка  результатов

   химического эксперимента и биологических испытаний" (ГФ  XI,  вып.

   1,  с.  199).  В  разделе II.5 данной статьи растворы определенных

   концентраций  стандартного  (С)   и   испытуемого   (И)   образцов

               S    U

   обозначены D  и D  соответственно.

       Определение антимикробной     активности     антибиотиков    с

   использованием  стандартной  кривой.  Постановка  опыта.  В   день

   постановки  анализа  из  основного  раствора  готовят пять рабочих

   растворов  стандартного   образца   C1,   С2,   С3,   С4,   C5   с

   концентрациями,  увеличивающимися в геометрической прогрессии (Z),

   обычно в соотношении 1:1,25.  Средняя концентрация  (С3)  является

   контрольной и  должна  быть  близка  к   концентрации,   указанной

   в табл. 17: концентрация  C1  - наименьшая,  C5 - наибольшая.  Для

   исследования растворов  каждой  концентрации  (кроме  контрольной)

   используют  по  три  чашки.  Раствор  контрольной  концентрации С3

   закапывают в три цилиндра (или лунки)  каждой  из  взятых  в  опыт

   чашек,  в  три другие цилиндра (лунки) закапывают раствор одной из

   концентраций  стандартного  образца,  чередуя  его   с   раствором

   контрольной    концентрации.   Таким   образом,   для   построения

   стандартной кривой используют 12 чашек.

       После инкубации в термостате измеряют диаметры  зон  угнетения

   роста тест - микробов.  Далее вычисляют среднюю величину диаметров

   зон  для  раствора контрольной концентрации стандартного образца в

   каждой группе из трех чашек,  затем среднюю величину диаметров зон

   для раствора контрольной концентрации стандартного образца из всех

   12 чашек (общую среднюю из 36  зон).  По  разности  между  средней

   величиной  зоны  контрольной  концентрации,  установленной  из  12

   чашек,  и  средней  величиной   зоны   контрольной   концентрации,

   установленной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят

   поправку к величине зоны данной концентрации.  Найденную  поправку

   прибавляют  к  средней величине диаметра зоны данной концентрации,

   если она положительная, и вычитают, если она отрицательная.

       Пример. Общая средняя величина зоны для  раствора  контрольной

   концентрации  стандартного  образца  1 мкг/мл,  рассчитанная из 36

   зон,  равна 19,2 мм.  Средняя величина зоны для  раствора  той  же

   концентрации,  установленная  из  3 чашек,  на которых испытывался

   раствор с концентрацией 0,83 мкг/мл стандартного образца, равна 19

   мм.  Следовательно,  величина  поправки  будет  +0,2  мм.  Средняя

   величина  зоны  для  концентрации  0,83  мкг/мл  равна  17,9   мм;

   прибавляя  поправку  +0,2  мм,  получаем  величину 18,1 мм.  Таким

   образом  исправляют  значение  величины  зон  для  растворов  всех

   концентраций стандартного образца и получают величины d1,  d2, d4,

   d5.

       Для исследования   активности   испытуемого  образца  проводят

   несколько определений, используя для каждого по 3 чашки, в которые

   закапывают раствор контрольной концентрации стандартного образца и

   раствор   испытуемого   образца   с   концентрацией,   близкой   к

   контрольной.    Внесение    растворов   контрольной   концентрации

   стандартного и испытуемого образцов в каждой группе из трех  чашек

   должно проводиться  одномоментно.  После  инкубации  измеряют зоны

   угнетения роста тест - микроба,  образуемые растворами контрольной

   концентрации стандартного и испытуемого образцов.  Находят среднее

   значение величин зон из 3 чашек.

       Расчет антимикробной   активности   испытуемых   образцов   по

   стандартной  кривой   может   быть   проведен   двумя   способами:

   графическим   методом   или   путем  непосредственного  расчета  с

   использованием соответствующих формул.

       Расчет активности испытуемого образца графическим методом.  По

   исправленным значениям диаметров зон  d1,  d2,  d4,  d5  для  всех

   концентраций растворов стандартного образца C1, C2, С4, C5 и общей

   средней величине диаметров зон  для  контрольной  концентрации  d3

   вычисляют с использованием метода наименьших квадратов размеры зон

   Dmin  и  Dmax  для  низкой  и   высокой   концентраций   растворов

   стандартного образца:

                   Dmin = (3d1 + 2d2 + d3 - d5) / 5;

                   Dmax = (3d5 + 2d4 + d3 - dl) / 5,

   по которым  затем строят стандартную кривую на полулогарифмической

   сетке расчета биологической активности антибиотиков, откладывая на

   оси  абсцисс  величины  зон,  на  оси ординат - соответствующие им

   концентрации  растворов  стандартного  образца.   Разность   между

   найденными средними  величинами зон угнетения роста тест - микроба

   раствором испытуемого образца и раствором контрольной концентрации

   стандартного  образца  из  тех  же  чашек  прибавляют  к  значению

   величины зоны,  соответствующей контрольной концентрации на кривой

   (D3).   Затем  по  кривой  находят  концентрацию,  соответствующую

   найденной величине зоны.  Умножением  полученной  концентрации  на

   степень  разведения  получают активность в 1 мл основного раствора

   или в 1 мг испытуемого образца.

       Пример. Средний  размер  зон  для раствора испытуемого образца

   при разведении 1:300 составляет 18,7 мм,  средний размер  зон  для

   раствора  стандартного образца,  содержащего 2 мкг/мл (контрольная

   концентрация) из тех же чашек - 18,5 мм.  Следовательно,  разность

   составляет  + 0,2 мм.  Эту разность прибавляют к величине зоны для

   раствора в концентрации 2 мкг/мл по  стандартной  кривой,  которая

   равна D3 = 18,6 мм, и получают величину 18,8 мм. Находят на кривой

   концентрацию,  соответствующую данному размеру зоны - 2,36 мкг/мл.

   Эту  величину умножают на степень разведения и получают содержание

   активного   вещества   в   1   мл   основного     раствора,  т. е.

   2,36 мкг/мл х 300 = 708 мкг/мл.

       Так как концентрация основного раствора составляла 1 мг/мл, то

   активность  испытуемого  образца  равна 708 мкг/мл:  1 мг/мл = 708

   мкг/мл.

       Определение активности  испытуемого  образца  расчетным путем.

   Кривая,  отражающая зависимость между  активностью  антибиотика  и

   размером зоны  угнетения  роста  тест - микроба,  после перехода к

   координатам логарифм   концентрации   (lg C) -  диаметр  зоны  (D)

   преобразуется в прямую, уравнение которой:

                           D = a + b x lg C,

   где а - свободный член; b - угловой коэффициент.

       По исправленным значениям величин диаметров зон d1, d2, d4, d5

   для растворов стандартного образца с концентрациями C1, С2, С4, С5

   и общей  средней  величине  диаметра  зоны   d3,   соответствующей

   контрольной С3,  рассчитывают  величины а и b с применением метода

   наименьших квадратов.  Так как концентрации C1,  С2,  С3,  С4,  C5

   составляют   геометрическую  прогрессию,  формулы  для  вычисления

   коэффициентов а и Ь могут быть записаны в виде:

             b = (-2 x d1 - d2 + d4 + 2 x d5) / 10 x lg Z;

                           a - d - Ь x lg C3,

   где Z - знаменатель прогрессии разведения;

                   _

                   d = (d1 + d2 + d3 + d4 + d5) / 5.

       Пример. Пусть знаменатель прогрессии разведения Z = 1,25, С3 =

   5,0,  а  средние  значения диаметров зон (в мм) равны: d1 = 17,64;

   d2 = 18,15; d3 = 19,03; d4 = 19,58; d5 = 20,09. Тогда:

    b = (-2 х 17,64 - 18,15 + 19,58 + 2 х 20,09) / (10 х lg 1,25) =

                        = 6,33 / 0,969 = 6,532.

        _

        d = (17,64 + 18,15 + 19,03 + 19,58 + 20,09) / 5 = 18,90;

                  а = 18,90 - 6,532 х 0,6990 = 14,33.

   Если в  опыте  с  одной  стандартной  кривой проведено n испытаний

   образца,  то логарифм среднего значения  концентрации  испытуемого

   образца в опыте рассчитывают по формуле:

                                       _    _

                    lg = C  = lg C3 + (d  - d ) / b,

                          U             U    S

   где С    -   среднее  значение  рабочей  концентрации  испытуемого

        U                                    _

   образца,  полученное  по  n  испытаниям;  d   -  среднее  значение

                                              U

   диаметра зон   задержки   роста,   полученное  по  n  параллельным

   испытаниям (3n чашкам);  d  -  среднее  значение  соответствующего

                             S

   диаметра   для  контрольной  концентрации,  полученное  в  тех  же

   испытаниях (по 3n чашки).

       Величину концентрации С  вычисляют как антилогарифм:

                              U

                          C = antilg (lg C ).

                           U              U

       Для получения  активности  испытуемого  образца  величину   С

                                                                    U

   умножают на его разведение в опыте - гамма .

                                             U

       Пример 1.  Пусть n = 1;  С3 = 5,0; d  = 18,61 и d  = 18,44 при

                           _               S _          U

   гамма  = 160.   Тогда:  d  = d  = 18,44;  d = d  = 18,61 и lg С  =

        U                   U    U            S   S               U

   0,6990 + (18,44 - 18,61) / 6,532 = 0,6730; С  = antilg (0,6730) =

   4,710; А  = 4,710 х 160 = 754.              U

           U

       Пример 2.  Пусть  n = 3;  С3 = 5,0;  d   = 18,61;  d   = 18,3;

                                             S1            S2

   d   = 18,12; d   = 18,44; d   = 18,1; d   = 18,3 при гамма  = 160.

    S3           U1           U2          U3                 U

   Тогда:

                _

                d  = (18,61 + 18,3 + 18,12) / 3 = 18,34;

                 S

                _

                d  = (18,44 + 18,1 + 18,3) / 3 = 18,28;

                 U

   lg С = 0,6990 + (18,28 - 18,34) / 6,532 = 0,6990 - 0,0092 = 0,6898;

       U

                     C  = antilg (0,6898) = 4,896;

                      U

                        А  = 4,896 х 160 = 783.

                         U

       Поскольку микробиологическое      исследование      активности

   антибиотиков подвержено вариабельности, следует проводить не менее

   6 повторных испытаний в разные дни (не  менее  2  дней),  так  как

   средняя  активность  отдельных  определений,  проведенных в разные

   дни, - более надежная величина, чем средняя активность, полученная

   в   результате   такого  же  количества  определений,  проведенных

   одновременно.

       Расчет ошибки  определения  логарифма концентрации испытуемого

   образца  в  пределах  одного  опыта  приведен  в   приложении 1  к

   настоящей  статье.  Объединение   результатов   отдельных   опытов

   проводят в соответствии с формулами,  приведенными в  приложении 2

   к настоящей статье.

       Во всех сомнительных  случаях  и  при  определении  активности

   стандартных   образцов  должен  использоваться  только  трехдозный

   вариант метода диффузии в агар.

       Для определения   содержания  активного  вещества  во  флаконе

   активность,  найденную в  1  мг,  умножают  на  массу  содержимого

   флакона,  выраженную  в  миллиграммах.  При исследовании раствора,

   приготовленного  из  всего   содержимого   флакона   или   ампулы,

   активность,  найденную  в  1  мл  этого раствора,  умножают на его

   объем.  В случае необходимости  определения  содержания  активного

   вещества   в   1   мг   испытуемого   образца   следует  величину,

   характеризующую  содержание   активного   вещества   во   флаконе,

   разделить на массу содержимого флакона, выраженную в миллиграммах.

       При определении содержания активного вещества в таблетках  или

   капсулах  их  количество,  а  также  подготовка для анализа должны

   соответствовать требованиям общих статей ГФ XI издания  "Таблетки"

   (с.  154)  и  "Капсулы"  (с.  143).  В дальнейшем основной раствор

   испытуемого образца  готовят  из  расчета  1  мг  в  1  мл.  После

   перемешивания раствору дают отстояться или центрифугируют. Рабочий

   раствор  испытуемого  образца  готовят  разведением   надосадочной

   жидкости основного раствора.  Для определения содержания активного

   вещества  в  1  таблетке  или  капсуле  активность  1  мг  порошка

   растертых  таблеток  или  содержимого  капсул  умножают на среднюю

   массу таблетки или содержимого капсулы, выраженную в миллиграммах.

       При исследовании   таблеток,  покрытых  оболочкой,  активность

   определяют в нескольких растворенных таблетках, количество которых

   и растворитель должны быть указаны в частных статьях.  Активность,

   найденную в 1 мл основного раствора, умножают на его объем и делят

   на количество растворенных в этом объеме таблеток.

       Выращивание и  хранение  культур  тест  -  микробов  <*>.  Все

   культуры  тест  -  микробов  сохраняют  в  запаянных  пробирках на

   соответствующих плотных питательных средах в течение 15-30 сут при

   температуре от 4 до 10 град.  С,  после чего пересеивают на свежую

   питательную  среду.  Тест  -   микробы   можно   сохранять   и   в

   лиофилизированном состоянии.

       --------------------------------

       <*> Штаммы  тест  -  микробов,  за  исключением Candida utilis

   ЛИА-01,  применяемые  для  определения  антимикробной   активности

   антибиотиков,  хранятся  в  музее  патогенных и условно патогенных

   культур при Государственном научно -  исследовательском  институте

   стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им.

   Л.  А.  Тарасевича.  Candida utilis ЛИА-01 хранится во  Всесоюзном

   научно -  исследовательском технологическом институте антибиотиков

   и ферментов медицинского назначения (ВНИТИАФ).

       Для характеристики  культурных  свойств  микроорганизмов  (см.

   табл.  18)  производится  их  высев  в пробирки с мясо - пептонным

   бульоном (МПБ),  затем через 18-20 ч инкубации при температуре (36

   +/-1)  град.  С культуры высеивают на чашки Петри с плотной средой

   для  выделения  типичных  колоний,  которые  затем  пересевают  на

   соответствующие  питательные  среды  для  получения  в  дальнейшем

   взвесей вегетативных клеток или спор.  Взвесь хранят  в  запаянных

   стеклянных пробирках при температуре от 4 до 10 град.  С в течение

   определенного срока.

       В полученной  взвеси  определяют концентрацию клеток (спор) по

   оптическому стандарту мутности <*> или нефелометрически  (основная

   взвесь).  Из этой взвеси по мере надобности готовят рабочую взвесь

   в соответствии  с  посевной  дозой,  предусмотренной  для  каждого

   тест - микроба (см. табл. 17).

       --------------------------------

       <*> Оптические   стандарты   мутности   и   инструкция  по  их

   использованию выпускаются и рассылаются Государственным  научно  -

   исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских

   биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича.

       Культуру тест - микроба Staphylococcus aureus 209P высевают на

   чашки  Петри  со  средой N 1 и после выращивания в течение 18-20 ч

   при (364 +/-1) град. С оставляют при комнатной температуре на 24 ч

   для наблюдения за образованием пигмента. Отбирают типичные колонии

   и пересевают их в пробирки со скошенным агаром того же состава.

       Для определения  активности  используют  взвесь  18-20-часовой

   культуры стафилококка,  выращенной в пробирке на скошенном  агаре.

   Возможно  также  применение  в  течение длительного времени взвеси

   культуры,  полученной следующим  образом:  культуру  выращивают  в

   течение 18-20 ч на скошенном агаре в пробирке,  смывают ее 5-10 мл

   стерильного   раствора   хлорида   натрия   изотонического   0,9%.

   Полученной  взвесью  засевают  матрац  с  300  мл  среды  N  1 (со

   скошенной поверхностью),  выращивают в течение 2  сут  [сутки  при

   (36 +/-1)  град.  С  и  сутки при комнатной температуре],  смывают

   примерно 50 мл стерильного раствора хлорида натрия  изотонического

   0,9%.  Взвесь  культуры  можно  хранить  в  запаянных  пробирках в

   течение 5-7 нед при температуре от 4 до 10 град. С.

       Культуру тест  -  микроба Bordetella bronchiseptica (ATCC 4617

   гладкая форма) выращивают так же,  как указано для  Staphylococcus

   aureus 209P,  за исключением времени инкубации, которое составляет

   для Bordetella bronchiseptica 30-36 ч.  Посевным материалом служит

   культура,  выращенная в пробирках со скошенным агаром и хранящаяся

   при температуре от 4 до 10 град. С не более 2 нед. Для длительного

   применения взвеси клеток культуру смывают с питательной среды 5-10

   мл  стерильного  раствора  натрия  хлорида  изотонического   0,9%,

   засевают  матрац со средой N 1 (со скошенной поверхностью) и далее

   поступают так  же,  как  при  подготовке  культуры  Staphylococcus

   aureus  209P.  Взвесь  клеток  Bordetella bronchiseptica ATCC 4617

   может храниться в течение 7 сут.

       Культуру тест  -  микроба  Pseudomonas  aeruginosa  N CTC 2134

   выращивают на чашках Петри со средой N 1 в  течение  18-20  ч  при

   температуре   (36   +/-1)  град.  С,  отбирают  типичные  колонии,

   пересевают их на мясо - пептонный  бульон  рН  от  7,2  до  7,4  и

   выращивают  в  вышеуказанных условиях.  Полученная культура служит

   посевным   материалом   для   приготовления   суточной   культуры,

   используемой при определении активности в каждом конкретном опыте,

   и может храниться в течение 30 сут при  температуре  от  4  до  10

   град. С.

       Культуру тест - микроба Candida utilis  ЛИА-01  выращивают  на

   чашках  Петри  со  средой  N  3 в течение 48 ч при температуре (30

   +/-1) град. С, отбирают типичные колонии, пересевают их в пробирки

   со  скошенным агаром того же состава и выращивают в указанных выше

   условиях.  Полученная  культура  служит  посевным  материалом  для

   приготовления  взвеси  клеток,  применяемой  в течение длительного

   времени.  Для этого культуру с поверхности среды смывают  5-10  мл

   стерильного раствора натрия хлорида изотонического 0,9% и засевают

   матрац с 300 мл среды N 3 (со скошенной поверхностью). Через 2 сут

   культуру   смывают  50  мл  стерильного  раствора  натрия  хлорида

   изотонического 0,9%.  По мере надобности готовят  рабочую  взвесь,

   густота  которой  должна быть такой,  чтобы при разведении ее в 30

   раз  0,9%  раствором  натрия  хлорида  изотонического   оптическая

   плотность  составляла  0,22-0,23.  Для  определения густоты взвеси

   используют нефелометр  с  нейтральным  светофильтром  и  кюветы  с

   толщиной  слоя  3 мм.  Рабочая взвесь может храниться в течение 30

   сут.

       При использовании  спорообразующих  культур  тест  -  микробов

   процесс выращивания  на  чашках  Петри,  отбор  типичных  колоний,

   пересев  на пробирки со скошенным агаром и на матрацы осуществляют

   так же, как указано для Staphylococcus aureus 209P.

       Для выращивания культур тест - микробов Вас. subtilis, var. Л2

   и Вас.  pumilus N CTC 8241 на чашках Петри и пробирках  используют

   среду  N  1,  при  выращивании  на  матрацах  -  среду  N  4;  для

   выращивания культур тест - микробов Вас.  cereus, var. mycoides HB

   и  Вас.  subtilis ATCC 6633 на чашках Петри и пробирках используют

   среду  N  1,  при  выращивании  на  матрацах  -  среду  N  5;  для

   выращивания культуры тест - микроба Вас. cereus, var. mycoides 537

   на  чашках  Петри  и  на  пробирках  используют  среду  N  2,  при

   выращивании на матрацах - среду N 4.

       Для получения взвеси спор культуру,  выращенную  в  пробирках,

   смывают 5-10 мл стерильного раствора натрия хлорида изотонического

   0,9%,  засевают  ею несколько матрацев с 300 мл питательной  среды

   (со  скошенной  поверхностью)  и  выращивают в течение 5-7 сут.  В

   процессе  выращивания  периодически  производят   микроскопический

   контроль культуры, и если в мазках, окрашенных по Граму, имеется в

   поле зрения    80-90%   спор,    производят    смыв     стерильной

   дистиллированной водой.

       Полученную взвесь спор прогревают при температуре от 60 до  70

   град.   С   в   течение   30   мин.   Затем  промывают  стерильной

   дистиллированной   водой   при   центрифугировании    до    полной

   прозрачности  надосадочной  жидкости.  Промытую  взвесь спор вновь

   прогревают в течение 30 мин при температуре от 60 до 70  град.  С.

   Взвесь   спор   хранят   в   запаянных  стеклянных  пробирках  при

   температуре от 4 до 10 град.  С и  используют  до  тех  пор,  пока

   интенсивность  роста  и четкость зон при определении антимикробной

   активности препаратов удовлетворяют предъявляемым требованиям.

       Для заражения   питательных   сред  допускается  использование

   лиофилизированных тест - культур  с  точно  известным  содержанием

   количества   микробных  клеток  (спор)  в  ампуле,  которые  после

   суспендирования в соответствующем  растворителе  (растворе  натрия

   хлорида  изотонического  0,9%  или дистиллированной воде) вносят в

   питательную среду без предварительного пересева.

       Питательные среды и буферные растворы.  В табл. 19 представлен

   состав сред, используемых при определении активности антибиотиков.

       Для приготовления сред N 4,  5, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 14, 15, 16

   применяют ферментативный гидролизат биомассы  микроорганизмов  без

   оболочек.  Методика приготовления состоит в следующем:  5 г сухого

   ферментативного гидролизата размешивают  в  1  л  дистиллированной

   воды,  прибавляют агар - агар,  расплавленный в открытом котле или

   автоклаве текучим паром или под давлением 0,05 МПа  и  температуре

   (111 +/- 1)  град.  С  в течение 30 мин.  В случае необходимости в

   среду прибавляют соли в количестве,  указанном в прописи сред;  рН

   сред  определяют потенциометрически со стеклянными электродами или

   колориметрически.     Реакцию     среды      (рН)      корригируют

   хлористоводородной кислотой или раствором едкого натрия.

       Готовые среды разливают в соответствующую посуду и стерилизуют

   в автоклаве  при  0,1  МПа  и  температуре  (120 +/- 1) град.  С в

   течение 15 мин.

                                                           Таблица 19

                Состав питательных сред для выращивания

                    тест - культур, получения спор и

                  определения активности антибиотиков

   -------------------------------------------------------------------

   |                |                Номера сред                     |

   |  Ингредиенты   |------------------------------------------------|

   |                |   1   |   2   |   3   |   4   |   5   |   6    |

   |-----------------------------------------------------------------|

   |                 Содержание каждого ингредиента                  |

   |-----------------------------------------------------------------|

   |Мясо - пептонный|1000 мл|1000 мл|1000 мл|  5 г  |  5 г  |  5 г   |

   |бульон 1:2      |       |       |       |       |       |        |

   |Ферментативный  |       |       |       |       |       |        |

   |гидролизат  био-|       |       |       |       |       |        |

   |массы микроорга-|       |       |       |       |       |        |

   |низмов без  обо-|       |       |       |       |       |        |

   |лочек           |       |       |       |       |       |        |

   |Агар - агар     | 20 г  | 20 г  | 17 г  | 25 г  | 25 г  | 10-15 г|

   |Глюкоза         |       |       | 10 г  |       |       |        |

   |Натрия фосфат   |       |       |       |       |       |        |

   |двузамещенный   |       |       |       |       |       |        |

   |Калия фосфат    |       |       |       |       |       |        |

   |однозамещенный  |       |       |       |       |       |        |

   |Натрия хлорид   |       |       |  5 г  |       |       |        |

   |Калия хлорид    |       |       |       |       |       |        |

   |Мочевина        |       |       |       |       |       |        |

   |Аммония цитрат  |       |       |       |       |       |        |

   |двузамещенный   |       |       |       |       |       |        |

   |Аммония хлорид  |       |       |       |       |       |        |

   |Вода            |       |       |       |       |       |        |

   |дистиллированная|       |       |       |1000 мл|1000 мл|1000 мл |

   |рН после        |       |       |       |       |       |        |

   |стеризации      |7,0-7,2|7,8-8,0|7,0-7,2|6,0-6,2|7,8-8,0|6,8-7,0 |

   -------------------------------------------------------------------

       Продолжение

   -------------------------------------------------------------------

   |                |                Номера сред                     |

   |  Ингредиенты   |------------------------------------------------|

   |                |   7   |   8   |   9   |  10   |  11   |  12    |

   |-----------------------------------------------------------------|

   |                 Содержание каждого ингредиента                  |

   |-----------------------------------------------------------------|

   |Мясо - пептонный|       |       |       |       |       |        |

   |бульон 1:2      |       |       |       |       |       |        |

   |Ферментативный  |  5 г  |  5 г  |  5 г  |  5 г  |       |        |

   |гидролизат  био-|       |       |       |       |       |        |

   |массы микроорга-|       |       |       |       |       |        |

   |низмов без  обо-|       |       |       |       |       |        |

   |лочек           |       |       |       |       |       |        |

   |Агар - агар     |10-12г |10-12г | 15 г  |10-15г |15-20 г|15-20 г |

   |Глюкоза         |       |       |       |       |       |        |

   |Натрия фосфат   |  3 г  |  3 г  |  3 г  |       |  3 г  |  3 г   |

   |двузамещенный   |       |       |       |       |       |        |

   |Калия фосфат    |       |       |       | 25 г  |       |        |

   |однозамещенный  |       |       |       |       |       |        |

   |Натрия хлорид   |       |       |       |       |       |        |

   |Калия хлорид    |       |       |       |       |       |        |

   |Мочевина        |       |       |       |       |       |        |

   |Аммония цитрат  |       |       |       |       |       |        |

   |двузамещенный   |       |       |       |       |       |        |

   |Аммония хлорид  |       |       |       |       |       |        |

   |Вода            |1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл |

   |дистиллированная|       |       |       |       |       |        |

   |рН после        |6,8-7,0|7,8-8,0|7,8-8,0|6,0-6,2|6,8-7,0|7,8-8,0 |

   |стерилизации    |       |       |       |       |       |        |

   -------------------------------------------------------------------

       Продолжение

   -------------------------------------------------------------------

   |                |                Номера сред                     |

   |  Ингредиенты   |------------------------------------------------|

   |                |  13   |  14   |  15   |  16   |  17   |  18    |

   |-----------------------------------------------------------------|

   |                 Содержание каждого ингредиента                  |

   |-----------------------------------------------------------------|

   |Мясо - пептонный|       |       |       |       |       |        |

   |бульон 1:2      |       |       |       |       |       |        |

   |Ферментативный  |  5 г  |  5 г  |  5 г  |       |       |  5 г   |

   |гидролизат  био-|       |       |       |       |       |        |

   |массы микроорга-|       |       |       |       |       |        |

   |низмов без  обо-|       |       |       |       |       |        |

   |лочек           |       |       |       |       |       |        |

   |Агар - агар     | 20 г  | 15 г  | 15 г  |18-20 г| 18 г  | 15-20 г|

   |Глюкоза         |       |       |       |       |  5 г  |  5 г   |

   |Натрия фосфат   |       |       |       |  5 г  | 15 г  |        |

   |двузамещенный   |       |       |       |       |       |        |

   |Калия фосфат    |       |       | 25 г  |       |       |        |

   |однозамещенный  |       |       |       |       |       |        |

   |Натрия хлорид   |       |       |       | 20 г  |       | 30 г   |

   |Калия хлорид    | 20 г  |       |       | 20 г  |       |        |

   |Мочевина        |       |       |       |       |  2 г  |        |

   |Аммония цитрат  |       |       |       |  5 г  |       |        |

   |двузамещенный   |       |       |       |       |       |        |

   |Аммония хлорид  |       |       |       |       |  2г   |        |

   |Вода            |1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл|1000 мл |

   |дистиллированная|       |       |       |       |       |        |

   |рН после        |7,0-7,2|7,8-8,0|7,0-7,2|5,8-6,0|7,8-8,0|6,8-7,0 |

   |стерилизации    |       |       |       |       |       |        |

   -------------------------------------------------------------------

       Мясо -  пептонный  бульон (среда N 1) готовят на водопроводной

   воде обычным способом, изложенным в руководствах по микробиологии.

       Примечания: 1.  Количество  агар  - агара в средах указано для

   цилиндро  -  чашечной  модификации.  В  случае  применения   лунок

   количество агар - агара увеличивают до 20-25 г на 1000 мл среды.

       2. Допускается уменьшение или  увеличение  содержания  агар  -

   агара в средах в зависимости от его качества.

       3. Допускается  использование  взамен  сред  с  ферментативным

   гидролизатом   биомассы  микроорганизмов  (без  оболочек)  сред  с

   другими источниками аминного азота:

       а) сухих  сред  на  основе   сухого   рыбного   бульона.   При

   использовании   данной   среды   в  отдельных  случаях  необходимо

   изменение посевной дозы тест - микроба и  увеличение  концентрации

   растворов стандартных и испытуемых образцов;

       б) сред   на  основе  панкреатического  гидролизата  мяса  (по

   Хоттингеру) глубокого расщепления.  Среды N 6,  7,  8,  10  должны

   содержать 130-140 мг% аминного азота, а среды N 4, 5, 9, 13 - 30 -

   35 мг%  аминного азота. Для приготовления сред с гидролизатом мяса

   применяют дистиллированную воду. Панкреатический гидролизат мяса и

   среды  на  его  основе  готовят  обычным  способом,  изложенным  в

   руководствах  по  микробиологии.  Условия  проведения  анализа  на

   средах с панкреатическим гидролизатом  не  отличаются  от  условий

   проведения   анализа   на  средах  с  ферментативным  гидролизатом

   биомассы микроорганизмов без оболочек.

       При контроле   активности  антибиотиков  применяются  буферные

   растворы, состав которых приводится в табл. 20.

                                                           Таблица 20

                       Состав буферных растворов

   --------------------------------------------------------------------

   |   Ингредиенты буферов    |       Содержание ингредиентов         |

   |                          |---------------------------------------|

   |                          |   1   |   2   |   3   |   4   |   5   |

   |--------------------------+-------+-------+-------+-------+-------|

   |Калия фосфат однозамещен- |       |       |       |       |       |

   |ный, г                    | 3,63  |   -   | 7,72  | 0,68  |  32   |

   |Калия фосфат двузамещен-  |       |       |       |       |       |

   |ный, г                    |   -   |   -   |       |       |   8   |

   |Натрия фосфат двузамещен- |       |       |       |       |       |

   |ный, г                    | 7,13  |   -   | 1,78  |10,99  |   -   |

   |Натрия цитрат трехзамещен-|       |       |       |       |       |

   |ный, г                    |   -   | 20,6  |   -   |   -   |       |

   |Кислота хлористоводородная|       |       |       |       |       |

   |концентрированная, г      |   -   | 1,81  |   -   |   -   |       |

   |Вода дистиллированная,  до|       |       |       |       |       |

   |1000 мл                   | 1000  | 1000  | 1000  | 1000  | 1000  |

   |рН буфера                 |6,8-7,0|5,8-6,0|6,0-6,2|7,8-8,0|6,0-6,2|

   --------------------------------------------------------------------

                                                         Приложение 1

       Вычисление ошибки  логарифма  активности   испытуемого  S

                                                                lg C

                                                                    U

   проводится    согласно    разделу    I.6    фармакопейной   статьи

   "Статистическая обработка результатов химического  эксперимента  и

   биологических испытаний".

                                                2

       Сначала вычисляют  величину  дисперсии  S ,    характеризующую

                                                0

   разброс    значений d1,  d2,  d3,  d4, d5   относительно    прямой

   D = a + b x lg C:

                 2      5                        2

                S  = [ SUM (di - (а + b x lg Ci)) ] / 3

                 0     i=1

       Тогда:

                   --------------------------------------------------

                  /  2                           _    _2

                 /  S                         5 (d  - d )

                /    0          1                 U    S

   S      =    /  -----  (0,2 + -- + ------------------------------),

    lg C      /     2           n      2    5    2      5        2

        U   \/     b                  b (5 SUM lg Ci - SUM lg Ci)

                                           i=1         i=1

   где n  -  число параллельных испытаний величины С ,  приведенных в

                                                    U

   опыте с одной стандартной кривой;  d  - среднее значение  диаметра

                                       U

   зон задержки роста для испытуемого, полученное по n испытаниям; d

                                                                    S

   - среднее значение диаметра зон  задержки  роста  для  контрольной

   концентрации, полученное по тем же n испытаниям.

       Число степеней свободы величины S      равно 3.

                                        lg C

                                            U

       Пример. Вычислим S      c    использованием  данных   примера,

                         lg C

                             U

   приведенного  в  основном тексте статьи для иллюстрации вычисления

   параметров стандартной кривой.

                2

       Расчеты S  удобно проводить с помощью следующей таблицы.

                0

   ------------------------------------------------------------------

   |  Ci    |  lg Ci | di  | a + b x |                      2|  2   |

   |        |        |     | x lg Ci |[di - (a + b x lg Ci)] |lg Ci |

   |--------+--------+-----+---------+-----------------------+------|

   |  3,2   | 0,5051 |17,64|  17,63  |       0,0001          |0,2551|

   |  4,00  | 0,6021 |18,15|  18,26  |       0,0121          |0,3625|

   |  5,00  | 0,6990 |19,03|  18,90  |       0,0169          |0,4886|

   |  6,25  | 0,7959 |19,58|  19,53  |       0,0025          |0,6334|

   |  7,8   | 0,8921 |20,09|  20,16  |       0,0049          |0,7958|

   |--------+--------+-----+---------+-----------------------+------|

   |Суммы по|        |     |         |                       |      |

   |столбцам| 3,4942 |     |         |       0,0365          |2,5354|

   ------------------------------------------------------------------

       При вычислении  значений   а  +  b x lg Ci   необходимо  брать

   достаточное число знаков для а и Ь.

       Пусть число испытаний образца в опыте n = 1, d = 18,61 и  d  =

                                                     S            U

   18,44

               _

         Тогда d  = d  = 18,61; d  = d  = 18,44. Найдем S      :

                S    S           U    U                  lg C

                                                             U

                        2

                       S = 0,0365 / 3 = 0,01217;

                        0

                 ---------------------------------------------------

                /                                             2

               /0,01217                   5 x (18,44 - 18,61)

   S     =    / ------- x (0,2 + 1+ x ------------------------------ =

    lg C     /        2                     2                      2

        U  \/   6,532                 6,532 x (5 х 2,5355 - 3,4943)

         = 0,0185.

                                                         Приложение 2

       Объединение результатов n опытов, выполненных с одним и тем же

   разведением   образца   гамма ,  проводится  усреднением  значений

                                U

   логарифмов активностей испытуемого с учетом ошибок их  определения

   в каждом опыте по формуле:

                     _      N                  N

                  lg C  = (SUM gj x lg C  ) / SUM gj,

                      U    j=1          Uj    j=1

                 2

   где gj = 1 / S x lg C  .

                        Uj            _

       Ошибка определения величины lg С  при этом будет равна:

                                       U

                                       ------

                                      / N

                      S   _  = 1 /   / SUM gj .

                       lg C        \/  j=1

                           U

       Доверительный интервал   для   величины   логарифма   истинной

   активности записывается  с  учетом  значения  критерия  Стьюдента,

   взятого  из  таблиц для доверительной вероятности Р = 0,95 и числа

                         N

   степеней свободы f = SUM fj,  где fj - число  степеней     свободы

                        j=1

   величины S       :

             lg С

                 Uj

                         _

                      lg C  +/- t(P, f) S   _

                          U              lg C .

                                             U

       Пример. Проведены   два   опыта   по   определению  активности

   препарата. Разведение испытуемого гамма  = 200. В первом опыте два

                                          U

   испытания дали следующие результаты:

              lg С1 = 0,6221; S      = 0,0170  при f1 = 3.

                               lg С1

        Во втором опыте по четырем испытаниям имели:

              lg C2 = 0,6305; S      = 0,0099 при f2 = 3.

                               lg C2

       Для объединения результатов проводят следующие вычисления:

                      2

       g1 = 1 / 0,017  = 3460;

                      2

       g2 = 1 - 0,0099  = 10203;

       g1 + g2 = 13663;

          _

       lg С  = (3460 х 0,6221 + 10203 х 0,6305) / 13663 = 0,6284;

           U

                        ------

       S    _  = 1 /  \/ 13663 = 0,0086.

         lg С

             U

       Границы доверительного   интервала   для   логарифма  истинной

   активности   образца    получают    с    использованием   величины

   t(0,95; 6) = 2,45:

       0,6284 +/- 2,45 х 0,0086 = 0,6284 +/- 0,0211.

       Таким образом,  нижняя граница 0,6073, верхняя граница 0,6495.

       Потенцируя, найдем среднее значение и  границы  доверительного

   интервала  для  истинной  активности  основного  рабочего раствора

   испытуемого:  4,250;  4,049;  4,462.  Учет степени разведения  при

   получении  основного  рабочего раствора позволяет получить среднее

   значение,  а  также  нижнюю  и  верхнюю  границу   несимметричного

   доверительного интервала для истинной активности испытуемого: 850;

   810; 892.

       Точность определения  должна быть такова,  чтобы доверительные

   границы при Р = 95%  отклонялись от среднего значения не более чем

   на +/- 5%.   В    данном   случае,   используя   верхнюю   границу

   доверительного интервала, имеем:

             892 - 850           42

             --------- х 100% = ----- х 100% = 4,94% < 5%.

                850              850

////////////////////////////