|
|
|
Государственная фармакопея СССР - часть 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТА В ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЯХ
Прибор для определения азота (рис.18) <*> состоит из
парообразователя 1 с предохранительной трубкой 2, сменных
грушевидных колб с длинным горлом 3, воронки для ввода щелочи 4 с
зажимом или краном 5, брызгоуловителя 6, прямого холодильника 7 и
сменных конических колб - приемников 8.
--------------------------------
<*> Рис. 18. Прибор для определения азота (объяснение в
тексте). (Рисунок не приводится).
В колбу 3 помещают точную навеску вещества, эквивалентную
0,014-0,035 г азота, прибавляют 1 г растертой смеси сульфата калия
и сульфата меди, взятых в отношении 10:1, и 7 мл концентрированной
серной кислоты. Колбу 3 устанавливают наклонно под углом 45 град.,
закрывают стеклянной воронкой и кипятят содержимое до получения
светло - зеленого раствора. После этого кипячение продолжают еще
30 мин. В некоторых случаях требуется более продолжительное
сжигание после просветления раствора, на что должно быть указано в
соответствующих частных статьях. По охлаждении в колбу 3 осторожно
приливают при перемешивании 20 мл воды, вновь охлаждают и
присоединяют колбу к прибору. В парообразователь 1 наливают воду,
подкисленную серной кислотой по метиловому красному. Для
обеспечения равномерного кипения воды в парообразователь 1
помещают стеклянные шарики. В приемник 8 перед началом отгонки
наливают 20 мл раствора борной кислоты и прибавляют 5 капель
смешанного индикатора. Нижний конец внутренней трубки холодильника
7 должен быть опущен в раствор борной кислоты. После сборки
прибора в холодильник 7 пускают воду и доводят до кипения воду в
парообразователе 1.
Затем в колбу 3 из воронки 4 через кран или зажим 5 медленно
прибавляют 40 мл 30% раствора едкого натра, следя за тем, чтобы
раствор в колбе 3 энергично перемешивался током пара. Для
обеспечения большей герметичности прибора в воронке 4 следует
оставлять некоторый избыток 30% раствора едкого натра. Собирают
100 мл отгона. Во время отгонки колбу 3 нагревают так, чтобы объем
жидкости в ней оставался постоянным.
По окончании отгонки опускают приемник, трубку холодильника
выводят из жидкости, промывают снаружи водой, продолжая подачу
пара в колбу 3 в течение 1-2 мин. Промывную воду собирают в тот же
приемник. После этого прекращают нагревание парообразователя 1 и
немедленно отсоединяют колбу 3 от прибора.
Отгон титруют раствором хлористоводородной кислоты (0,1
моль/л) до перехода окраски индикатора из зеленой в
красно - фиолетовую.
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора хлористоводородной кислоты (0,1 моль/л)
соответствует 0,001401 г азота.
Примечания. 1. При минерализации трудносжигаемых веществ
допускается использование катализаторов: 0,05 г металлического
селена или 0,3 г окиси ртути, на что должно быть указано в частных
статьях.
2. В случае применения прибора, в котором для соединения
отдельных частей используются резиновые трубки и пробки, перед
первым употреблением их необходимо прокипятить в течение 10 мин в
5% растворе едкого натра и тщательно промыть водой.
МЕТОД СЖИГАНИЯ В КОЛБЕ С КИСЛОРОДОМ
Метод сжигания веществ в атмосфере кислорода применяется для
определения галогенов (хлора, брома, йода, фтора, серы и фосфора).
Сущность метода состоит в разрушении органических веществ
сожжением в атмосфере кислорода, растворении образующихся
продуктов сгорания в поглощающей жидкости и последующем
определении элементов, находящихся в растворе в виде ионов.
Сожжение проводят в конической или круглодонной колбе
вместимостью 750-1000 мл из термостойкого стекла со шлифом. В
пробку колбы впаяна платиновая или нихромовая проволока диаметром
0,7-0,8 мм, заканчивающаяся платиновой или нихромовой корзиночкой
или спиралью (держатель) (рис. 19) <*>, находящимися на расстоянии
1,5-2 см от дна колбы.
--------------------------------
<*> Рис. 19. Прибор для сжигания в кислороде. (Рисунок не
приводится).
Около 0,05 г тонкоизмельченного вещества (точная навеска)
насыпают на кусочек фильтровальной бумаги (рис. 20) <*>, которую
заворачивают в виде пакетика, оставляя узкую полоску.
--------------------------------
<*> Рис. 20. Фильтровальная бумага для приготовления пакетика.
(Рисунок не приводится).
При исследовании жидкости навеску помещают в капилляр,
заплавленный парафином, или в капсулу - полиэтиленовую, из
нитропленки или метилцеллюлозы. Для труднолетучих жидкостей
возможно применение двойного бумажного пакетика.
При исследовании мазеобразных веществ применяют капсулу из
нитропленки или пакет из вощаной бумаги. Капсулы и капилляры
заворачивают в пакетик из фильтровальной бумаги, оставляя узкую
полоску. При анализе твердых и мазеобразных соединений, сгорающих
со вспышкой, к навеске прибавляют 3-5 мг парафина. Подготовленную
пробу помещают в держатель.
В колбу для сжигания наливают воду или другую поглощающую
жидкость и пропускают в течение 3-5 мин ток кислорода. Затем
поджигают свободный конец узкой полоски фильтровальной бумаги и
немедленно плотно закрывает колбу пробкой, смоченной водой; во
время сжигания следует придерживать пробку рукой. По окончании
сжигания колбу оставляют на 30-60 мин при периодическом
перемешивании, после чего проводят определение тем или иным
методом, подходящим для данного элемента.
Параллельно проводят контрольный опыт.
Примечание. При работе соблюдать осторожность (надеть защитные
очки, колбу поместить в предохранительный чехол, установить
защитный экран). Колба для сжигания должна быть тщательно вымыта и
свободна от следов органических веществ и растворителей.
Определение хлора и брома
Точную навеску вещества, указанную в частной статье, сжигают,
как описано выше, используя в качестве поглощающей жидкости 20 мл
6 % раствора перекиси водорода. Стенки колбы и держатель образца
обмывают 40 мл воды, прибавляют 5 капель 0,1 % спиртового раствора
бромфенолового синего и нейтрализуют по каплям раствором едкого
натра (0,1 моль/л) до перехода желтой окраски в синюю. Затем
прибавляют 1 мл 0,3% раствора азотной кислоты, 5 капель раствора
дифенилкарбазона и титруют раствором нитрата окисной ртути (0,01
моль/л) до перехода желтой окраски в светло - фиолетовую.
1 мл раствора нитрата окисной ртути (0,01 моль/л)
соответствует 0,0007090 г хлора или 0,001598 г брома.
Определение йода
Точную навеску вещества, указанную в частной статье, сжигают,
как описано выше, поглощая продукты сжигания 10 мл раствора едкого
натра (0,2 моль/л). Шлиф и держатель обмывают 25 мл 10% раствора
ацетата калия в ледяной уксусной кислоте, к которому
предварительно прибавляют 15 капель брома, затем пробку с
держателем и стенки колбы тщательно отмывают 40 мл воды,
прибавляют по каплям 85% муравьиную кислоту до обесцвечивания
раствора, 20 мл раствора серной кислоты (0,05 моль/л), 0,5 г
йодида калия и выдерживают в темном месте в течение 5 мин.
Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия (0,1 моль/л)
(индикатор - крахмал).
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,002116 г йода.
Определение фтора
Точную навеску вещества, указанную в частной статье, сжигают,
как описано выше, поглощая продукты сжигания 15 мл воды. Пробку,
держатель образца и стенки колбы обмывают 40 мл воды и в колбу
вносят 0,6 мл раствора ализаринового красного С. Прибавляют по
каплям раствор едкого натра (0,1 моль/л) до красно - малинового
окрашивания и затем 2-3 капли 1,5% раствора азотной кислоты до
перехода окрашивания в желтое, 3,5 мл буферного раствора рН 3,0
(см. примечание) и титруют раствором нитрата тория (0,005 моль/л)
до розовой окраски.
1 мл раствора нитрата тория (0,005 моль/л) соответствует
0,000380 г фтора.
Для облегчения установления перехода окраски индикатора
рекомендуется проведение предварительного титрования с известной
навеской фторида натрия.
Примечание. Буферный раствор рН 3,0: растворяют 2,0 г
монохлоруксусной кислоты в 20 мл воды и нейтрализуют раствором
едкого натра (1 моль/л) до слабо - розовой окраски по
фенолфталеину. Затем прибавляют 2,0 г монохлоруксусной кислоты и
доводят объем раствора водой до 100 мл.
2. Точную навеску вещества, указанную в частной статье,
сжигают, как описано выше, раствор переносят в мерную колбу
вместимостью 100 мл, прибавляют по 25 мл 0,01% раствора арсеназо-1
и раствор нитрата тория (0,005 моль/л), доводят объем раствора
водой до метки и перемешивают. Через 30 мин измеряют оптическую
плотность полученного раствора при длине волны 580 нм. Содержание
фтора находят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. В мерные колбы вместимостью
100 мл вносят 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 и 8,0 мл стандартного раствора
фтора и далее поступают, как указано выше, начиная со слов "...
прибавляют по 25 мл". Измерение оптической плотности производят не
менее 3 раз. Строят калибровочный график, откладывая по оси
абсцисс количество микрограммов фтора, а по оси ординат - средние
значения оптической плотности.
Примечание. Приготовление стандартного раствора фтора: 0,0552
г (точная навеска) фторида натрия растворяют в воде в мерной колбе
вместимостью 250 мл и доводят объем раствора водой до метки. 5 мл
этого раствора разводят водой в мерной колбе вместимостью 50 мл до
метки. 1 мл полученного раствора содержит 10 мкг фтор-иона.
Определение серы
Точную навеску вещества, указанную в частной статье, сжигают,
как описано выше, используя в качестве поглощающей жидкости 15 мл
6% раствора перекиси водорода. Держатель образца и стенки обмывают
20 мл воды и выпаривают содержимое колбы до 4-5 мл. К охлажденному
раствору прибавляют 2 мл разведенной уксусной кислоты, 20 мл 95%
спирта и титруют раствором нитрата бария (0,01 моль/л) до перехода
желто - зеленой окраски в розовую со смешанным индикатором (по 2
капли 0,02% водного раствора метиленового синего и 0,2% раствора
торона).
1 мл раствора нитрата бария (0,01 моль/л) соответствует
0,0003206 г серы.
Определение фосфора
Точную навеску вещества, указанную в частной статье, сжигают,
как описано выше, используя в качестве поглощающей жидкости 10 мл
раствора серной кислоты (0,1 моль/л). Раствор выпаривают до
появления паров сернистого ангидрида и переносят количественно в
мерную колбу вместимостью 100 мл.
Раствор нейтрализуют насыщенным раствором карбоната натрия по
фенолфталеину до розовой окраски. Прибавляют 5 мл смеси равных
объемов 50% раствора молибдата аммония и концентрированной серной
кислоты, перемешивают и оставляют на 5 мин. Затем прибавляют 2 мл
раствора восстановителя и через 10 мин - 20 мл 40% раствора
ацетата натрия. Объем раствора доводят водой до метки,
перемешивают и измеряют оптическую плотность полученного раствора
при 750 нм.
Содержание фосфора находят по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика. В мерные колбы вместимостью
100 мл вносят 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0; 10,0 мл стандартного
раствора фосфора и далее поступают, как указано выше, начиная со
слов: "Прибавляют 5 мл смеси равных объемов 50% раствора молибдата
аммония..."
Строят калибровочный график, откладывая по оси ординат
соответствующие значения оптической плотности.
Примечания. 1. Приготовление стандартного раствора фосфора:
0,0440 г (точная навеска) однозамещенного фосфата калия растворяют
в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора
водой до метки. 10 мл этого раствора переносят в мерную колбу
вместимостью 50 мл и доводят объем раствора водой до метки. 1 мл
полученного раствора содержит 20 мкг фосфора.
2. Приготовление раствора восстановителя: 10 г метола и 6 г
безводного сульфита натрия растворяют в мерной колбе вместимостью
500 мл и доводят объем раствора водой до метки.
КОМПЛЕКСОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ
Комплексонометрическое титрование основано на реакции
комплексообразования катионов металлов с комплексонами -
аминополикарбоновыми кислотами и их солями. Образующиеся
комплексные соединения называют комплексонатами.
Из известных в настоящее время комплексонов наибольшее
применение для комплексонометрического титрования получила
динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, встречающаяся
в литературе под названиями: трилон Б, комплексон III, хелатон III
и др. Трилон Б образует с катионами различных металлов в
стехиометрическом отношении (1:1) устойчивые и хорошо растворимые
в воде комплексонаты и используется для количественного
определения кальция, магния, цинка, висмута, свинца и алюминия в
лекарственных препаратах.
Индикаторы, применяемые для визуального определения,
называются металлоиндикаторами. Они являются органическими
красителями и обладают способностью изменять окраску при
образовании комплексных соединений с катионами металлов.
Металлоиндикаторы для комплексонометрии подбираются так, чтобы их
взаимодействие с катионами определяемых металлов было обратимым и
устойчивость соответствующих комплексов была заметно меньше
устойчивости комплексонатов, образующихся в процессе титрования.
Прямое титрование растворами трилона Б проводят следующим
образом: к анализируемому раствору прибавляют буферный раствор,
имеющий необходимое значение рН, и небольшое количество
металлоиндикатора. В точке эквивалентности окраска раствора
изменяется от окраски свободного металлоиндикатора до окраски,
свойственной его комплексу с катионом титранта.
При обратном титровании избыток трилона Б, не вступивший в
соединение с определяемым катионом, оттитровывают при определенном
значении рН и в присутствии соответствующего металлоиндикатора
растворами солей цинка, магния, свинца и др.
Методика определения катионов
Алюминий: Точную навеску препарата (соответствующую 0,02-0,03
г алюминия) растворяют в 2 мл раствора хлористоводородной кислоты
(1 моль/л) и 50 мл воды. Прибавляют 50 мл раствора трилона Б (0,05
моль/л) и нейтрализуют раствором едкого натра (1 моль/л) по
метиловому красному. Нагревают раствор до кипения и выдерживают на
кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждают, прибавляют 0,05
г индикаторной смеси ксиленового оранжевого, 5 г
гексаметилентетрамин и титруют избыток трилона Б раствором нитрата
свинца (0,05 моль/л) до розово - фиолетового окрашивания.
1 мл раствора трилона Б (0,05 моль/л) соответствует 0,001349 г
алюминия.
Висмут. Точную навеску препарата (соответствующую 0,1-0,2 г
висмута) растворяют, как указано в частной статье. Прибавляют 50
мл воды и доводят рН до 1,0-2,0, добавляя по каплям разведенную
азотную кислоту или раствор аммиака. Прибавляют 0,05 г
индикаторной смеси ксиленолового оранжевого и медленно титруют
раствором трилона Б (0,05 моль/л) до желтого окрашивания.
1 мл раствора трилона Б (0,05 моль/л) соответствует 0,01045 г
висмута.
Кальций. Точную навеску препарата (соответствующую 0,04-0,05 г
кальция) растворяют, как указано в частной статье, в воде или
разведенной хлористоводородной кислоте и далее проводят
определение по одному из приведенных способов.
1. Доводят объем раствора водой до 100 мл и титруют раствором
трилона Б (0,05 моль/л). В конце титрования прибавляют 4 мл 30%
раствора едкого натра, 3 мл раствора кальконкарбоновой кислоты,
появляется розовое окрашивание; продолжают титрование до перехода
окраски в интенсивно синий цвет.
2. Доводят объем раствора водой до 50 мл, прибавляют 10 мл
буферного раствора с рН 9,5-10,0; 0,1 г индикаторной смеси или 7
капель раствора индикатора хромового темно - синего и титруют
раствором трилона Б (0,05 моль/л) до сине - фиолетового
окрашивания.
1 мл раствора трилона Б (0,05 моль/л) соответствует 0,002004 г
кальция.
Свинец. Точную навеску препарата (соответствующую 0,1-0,2 г
свинца) растворяют, как указано в частной статье. Прибавляют 50 мл
воды, 0,05 г индикаторной смеси ксиленолового оранжевого, 5 г
гексаметилентетрамина и титруют раствором трилона Б (0,05 моль/л)
до желтого окрашивания.
1 мл раствора трилона Б (0,05 моль/л) соответствует 0,01035 г
свинца.
Магний. Точную навеску препарата (соответствующую 0,02-0,03 г
магния) растворяют, как указано в частной статье. Прибавляют 50 мл
воды, 10 мл буферного раствора с рН 9,5-10,0; 0,1 г индикаторной
смеси или 7 капель раствора индикатора эриохрома черного Т и
титруют раствором трилона Б (0,05 моль/л) до синего окрашивания.
1 мл раствора трилона Б (0,05 моль/л) соответствует 0,001215 г
магния.
Цинк. Точную навеску препарата (соответствующую 0,06-0,08 г
цинка) растворяют, как указано в частной статье. Прибавляют 50 мл
воды, 0,05 г индикаторной смеси ксиленолового оранжевого, 5 г
гексаметилентетрамина и титруют раствором трилона Б (0,05 моль/л)
до желтого окрашивания.
1 мл раствора трилона Б (0,05 моль/л) соответствует 0,003268 г
цинка.
ИНДИКАТОРЫ К СТАТЬЕ
"КОМПЛЕКСОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ"
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Кальконкарбоновая кислота
3-Окси-4-(2-окси-4-сульфо-1-нафтилазо)-2-нафтойная кислота
(ч.д.а.)
C21H14N2О7S М.м. 438,41
Темно - коричневый порошок с фиолетовым оттенком, практически
нерастворим в воде, растворим в 50% ацетоне, спирте, легко
растворим в растворах едких щелочей. В щелочной среде (рН > 12,0)
имеет голубую окраску, а его комплексы с кальцием в тех же
условиях - красновато - сиреневую. Переход окраски при прямом
титровании от красновато - сиреневой к голубой.
Индикаторная смесь. 0,1 г индикатора и 10 г натрия сульфата
безводного растирают в ступке и перемешивают.
Раствор индикатора. 0,025 г индикатора растворяют в 100 мл 50%
спирта или ацетона.
Срок годности 2 мес.
На 100 мл титруемой жидкости берут 0,1 г индикаторной смеси
или 3 мл раствора индикатора.
Хромовый темно - синий (кислотный хром темно - синий)
2-(5-Хлор-2-оксифенил)-азо-1,8-диоксинафталин-
3,6-дисульфокислоты динатриевая соль (ч.д.а.)
C16H9ClN2Na2О9S2 М.м. 518,82
Однородный порошок темно - коричневого цвета. В щелочной среде
(рН 9,5-10,0) имеет сине - фиолетовую окраску, а его комплексы с
кальцием, магнием и цинком в тех же условиях вишнево - красного
цвета.
Переход окраски при прямом титровании от вишнево - красной к
сине - фиолетовой.
Индикаторная смесь. 0,25 г индикатора и 25 г натрия хлорида
(х.ч.) растирают в ступке и перемешивают.
Раствор индикатора. 0,5 г индикатора растворяют в 10 мл
аммиачного буферного раствора (рН 9,5-10,0) и доводят объем
раствора до 100 мл 95% спиртом.
Срок годности 1 мес.
На 50 мл титруемой жидкости берут около 0,1 г индикаторной
смеси или 7 капель раствора индикатора.
Эриохром черный Т (протравной черный II)
1-(1-Окси-2-нафтилазо)-6-нитро-2-нафтол-4-сульфокислоты
натриевая соль (ч.д.а.)
C20H12N3NaО7S М.м. 461,39
Однородный порошок темно - коричневого цвета. Мало растворим в
воде. В щелочной среде (рН 9,5-10,0) имеет синюю окраску, а его
комплексы с кальцием, магнием и цинком в тех же условиях красно -
фиолетового цвета.
Переход окраски при прямом титровании от красно - фиолетовой к
синей.
Индикаторная смесь. 0,25 г индикатора и 25 г натрия хлорида
(х.ч.) растирают в ступке и перемешивают.
Раствор индикатора. 0,25 г индикатора и 2,25 г гидроксиламина
гидрохлорида растворяют в 50 мл метилового спирта.
Срок годности 15 дней.
На 50 мл титруемой жидкости берут около 0,1 г индикаторной
смеси или 7 капель раствора индикатора.
Ксиленоловый оранжевый
1 1
3,3 -Бис-[N, N -ди-(карбоксиметил)-аминометил]- о- -
крезолсульфофталеина тетранатриевая соль (ч.д.а.)
C31H28N2Na4О13S М.м. 760,58
Красно - коричневый блестящий кристаллический порошок, легко
растворим в воде, разведенных кислотах; нерастворим в спирте и
эфире; в сильнокислых растворах имеет розовую окраску, переходящую
при рН > 2,0 в желтую; в щелочной среде (рН > 6,0) окрашен в
красно - фиолетовый цвет.
Переход окраски при прямом титровании от красной к желтой.
Индикаторная смесь. 0,1 г индикатора и 10 г калия нитрата
растирают в ступке и перемешивают.
Раствор индикатора. 0,25 г индикатора растворяют в 100 мл
воды.
Срок годности 1 мес.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
БУФЕРНЫЙ РАСТВОР рН 9,5-10,0
54 г аммония хлорида растворяют в 200 мл воды, прибавляют 350
мл 25% раствора аммиака и доводят объем раствора водой до 1 л.
Срок годности 3 мес.
ПРИЛОЖЕНИЕ 3
РАСТВОР ТРИЛОНА Б (0,05 МОЛЬ/Л)
C10H14N2Na2О8 х 2Н2О М.м. 372,24
1 мл раствора содержит 0,01861 г динатриевой соли
1 1
этилендиамин-N, N, N , N -тетрауксусной кислоты двухводной.
Приготовление. 18,8 г трилона Б (ГОСТ 10652-73) растворяют в
воде, доводят объем раствора водой до 1 л и фильтруют.
Установка титра. Около 3,27 г (точная навеска) металлического
цинка (ГОСТ 3640-79, марки ЦВ или ЦО) растворяют в 40 мл
разведенной серной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 л и по
растворении доводят объем раствора водой до метки.
Точно отмеривают из бюретки 25 мл приготовленного раствора
цинка, прибавляют 5 мл буферного раствора рН 9,5-10,0, около 0,1 г
индикаторной смеси эриохрома черного Т, 70 мл воды, перемешивают и
титруют раствором (0,05 моль/л) трилона Б (от фиолетового до
ярко - синего окрашивания).
Поправочный коэффициент (с учетом разведения) вычисляют по
первому способу:
25 х а
К = -------------------.
1000 х 0,003269 х V
НИТРИТОМЕТРИЯ
Нитритометрия - метод объемного анализа, при котором в
качестве реактива для титрования используется раствор нитрита
натрия.
Применяется для количественного определения соединений,
содержащих первичную или вторичную ароматическую аминогруппу, для
определения гидразидов, а также ароматических нитросоединений
после предварительного восстановления нитрогруппы до аминогруппы.
Методика определения. Точную массу препарата (около 0,001
г/моль) растворяют в смеси 10 мл воды и 10 мл разведенной
хлористоводородной кислоты. Прибавляют воды до общего объема 80
мл, 1 г бромида калия и при постоянном перемешивании титруют
раствором нитрита натрия (0,1 моль/л), прибавляя его в начале со
скоростью 2 мл в минуту, а в конце титрования (за 0,5 мл до
эквивалентного количества) по 0,05 мл через 1 мин.
Титрование проводят, поддерживая температуру раствора 15-20
град. С, однако в некоторых случаях требуется охлаждение до 0-5
град. С.
Точку эквивалентности определяют электрометрическими методами
(потенциометрическое титрование, титрование "до полного
прекращения тока") или с помощью внутренних индикаторов и внешнего
индикатора (йодкрахмальная бумага).
При потенциометрическом титровании в качестве индикаторного
электрода применяют платиновый электрод, электродом сравнения
служит хлорсеребряный или насыщенный каломельный электрод.
Титрование методом "до полного прекращения тока" проводят в
соответствии с общей статьей "Электрометрические методы
титрования" <*>. При использовании модифицированной схемы на
электроды накладывают разность потенциалов 0,3-0,4 В.
--------------------------------
<*> См. с. 120, п. 2.
В качестве внутренних индикаторов используют тропеолин 00 (4
капли раствора), тропеолин 00 в смеси с метиленовым синим (4 капли
раствора тропеолина 00 и 2 капли раствора метиленового синего) или
нейтральный красный (2 капли раствора в начале и 2 капли в конце
титрования). Титрование с тропеолином 00 ведут до перехода окраски
от красной к желтой, со смесью тропеолина 00 с метиленовым синим -
от красно - фиолетовой к голубой, с нейтральным красным - от
красно - фиолетовой к синей. Выдержку в конце титрования с
нейтральным красным увеличивают до 2 мин.
Титрование с йодкрахмальной бумагой ведут до тех пор, пока
капля титруемого раствора, взятая через 1 мин после прибавления
раствора нитрита натрия, не будет немедленно вызывать синее
окрашивание на бумаге. Параллельно проводят контрольный опыт. В
некоторых случаях выдержка может быть увеличена, о чем должно быть
указано в частной статье.
КИСЛОТНОЕ ЧИСЛО
Кислотным числом называют количество миллиграммов едкого кали,
необходимое для нейтрализации свободных кислот, содержащихся в 1 г
исследуемого вещества.
Определение кислотного числа. Около 10 г (точная навеска)
масла, жира, воска или около 1 г (точная навеска) смолы помещают в
колбу вместимостью 250 мл и растворяют в 50 мл смеси равных
объемов 95% спирта и эфира, предварительно нейтрализованной по
фенолфталеину раствором едкого натра (0,1 моль/л); если
необходимо, нагревают с обратным холодильником на водяной бане до
полного растворения. Прибавляют 1 мл раствора фенолфталеина и
титруют при постоянном помешивании раствором едкого натра (0,1
моль/л) до появления розового окрашивания, не исчезающего в
течение 30 с. Для вещества с небольшим кислотным числом (до 1)
титрование проводят из микробюретки.
Кислотное число (Кч) вычисляют по формуле:
а х 5,61
Кч = --------,
б
где а - количество миллилитров раствора едкого натра (0,1
моль/л), израсходованное на титрование; б - навеска вещества в
граммах; 5,61 - количество миллиграммов едкого кали,
соответствующее 1 мл раствора едкого натра (0,1 моль/л).
ЧИСЛО ОМЫЛЕНИЯ
Числом омыления называют количество миллиграммов едкого кали,
необходимое для нейтрализации свободных кислот и кислот,
образующихся при полном гидролизе сложных эфиров, содержащихся в 1
г исследуемого вещества.
Определение числа омыления. Около 2 г вещества (точная
навеска) помещают в колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 25 мл
спиртового раствора едкого кали (0,5 моль/л), присоединяют к колбе
обратный холодильник, погружают ее в кипящую водяную баню и
нагревают в течение 1 ч, регулярно перемешивая путем вращения.
При исследовании трудно омыляющихся веществ прибавляют 5-10 мл
ксилола и нагревают более продолжительное время, согласно
указаниям в частных статьях.
Параллельно нагревают 25 мл спиртового раствора едкого кали
(0,5 моль/л). Оба раствора тотчас же после прекращения нагревания
разбавляют 25 мл свежепрокипяченной горячей воды, прибавляют по 1
мл раствора фенолфталеина и титруют раствором хлористоводородной
кислоты (0,5 моль/л) до обесцвечивания.
Из количества миллилитров раствора хлористоводородной кислоты
(0,5 моль/л), израсходованного в контрольном опыте, вычитают
количество миллилитров раствора хлористоводородной кислоты (0,5
моль/л), израсходованное на титрование исследуемого вещества.
Полученная разность представляет собой количество миллилитров
раствора едкого кали (0,5 моль/л), израсходованное на
нейтрализацию свободных кислот и кислот, образовавшихся при полном
гидролизе сложных эфиров во взятой навеске.
Число омыления (Ч) вычисляют по формуле:
(а - б) 28,05
Ч = ---------------,
в
где а - количество миллилитров раствора хлористоводородной
кислоты (0,5 моль/л), израсходованное на титрование в контрольном
опыте; б - количество миллилитров раствора хлористоводородной
кислоты (0,5 моль/л), израсходованное на титрование исследуемого
вещества; в - навеска вещества в граммах; 28,05 - количество
миллиграммов едкого кали, соответствующее 1 мл раствора едкого
кали (0,5 моль/л).
ЭФИРНОЕ ЧИСЛО
Эфирным числом называют количество миллиграммов едкого кали,
необходимое для нейтрализации кислот, образующихся при гидролизе
сложных эфиров, содержащихся в 1 г исследуемого вещества.
Эфирное число определяют по разности между числом омыления и
кислотным числом.
ЙОДНОЕ ЧИСЛО
Йодным числом называют количество граммов йода, связываемое
100 г исследуемого вещества.
Определение йодного числа. Точную навеску исследуемого
вещества (см. примечание) помещают в сухую колбу с притертой
пробкой вместимостью 250-300 мл, растворяют в 3 мл эфира или
хлороформа, прибавляют 20 мл раствора йода монохлорида (0,1
моль/л), закрывают колбу пробкой, смоченной раствором йодида
калия, осторожно взбалтывают вращательным движением и выдерживают
в темном месте в течение 1 ч. Затем прибавляют последовательно 10
мл раствора йодида калия, 50 мл воды и титруют раствором
тиосульфата натрия (0,1 моль/л) при постоянном энергичном
взбалтывании до светло - желтой окраски, после чего прибавляют 3
мл хлороформа, сильно взбалтывают, затем прибавляют 1 мл раствора
крахмала и титруют до обесцвечивания.
Параллельно проводят контрольный опыт.
При анализе твердых жиров навеску растворяют в 6 мл эфира,
прибавляют 20 мл раствора йода монохлорида (0,1 моль/л) и 25 мл
воды. Дальнейшее определение проводят, как указано выше.
Из количества миллилитров раствора тиосульфата натрия (0,1
моль/л), израсходованного в контрольном опыте, вычитают количество
миллилитров раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л),
израсходованное на титрование исследуемого вещества. Полученная
разность соответствует количеству миллилитров раствора йода (0,1
моль/л), связанному навеской исследуемого вещества.
Йодное число (I) вычисляют по формуле:
(а - б) х 0,01269 х 100
I = -----------------------,
в
где а - количество миллилитров раствора тиосульфата натрия
(0,1 моль/л), израсходованное на титрование в контрольном опыте;
б - количество миллилитров раствора тиосульфата натрия (0,1
моль/л), израсходованное на титрование исследуемого вещества; в -
навеска вещества в граммах.
Приготовление раствора йода монохлорида (0,1 моль/л). 11,06 г
йодида калия и 7,10 г йодата калия помещают в склянку с притертой
пробкой, прибавляют 50 мл воды и 50 мл концентрированной
хлористоводородной кислоты, закрывают пробкой и встряхивают до
полного растворения образующегося при реакции йода. Раствор
переносят в делительную воронку и взбалтывают с 10 мл хлороформа.
Если хлороформный слой окрашивается в фиолетовый цвет, то
прибавляют при сильном взбалтывании по каплям 1% раствор йодата
калия до обесцвечивания хлороформного слоя. Если же хлороформный
слой остается бесцветным, то прибавляют по каплям 1% раствор
йодида калия до появления бледно - розовой окраски. После
отстаивания водный слой сливают в мерную колбу и доводят объем
раствора водой до 1 л. Приготовленный раствор должен иметь
лимонно - желтый цвет.
Примечание. Величина навески вещества в граммах в зависимости
от ожидаемого йодного числа приведена в нижеследующей таблице.
Љ””””””””””””””””””””””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””””Ї
Ј Йодное число Ј Навеска, г Ј
“””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј От 0 до 30 Ј 1,1 - 0,7 Ј
Ј >> 31 >> 50 Ј 0,7 - 0,5 Ј
Ј >> 51 >> 100 Ј 0,5 - 0,25 Ј
Ј >> 101 >> 150 Ј 0,25 - 0,15 Ј
Ј Свыше 150 Ј Менее 0,15 Ј
ђ””””””””””””””””””””””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””””””‰
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКРАСКИ ЖИДКОСТЕЙ
Окраску жидкостей определяют визуально путем сравнения с
соответствующими эталонами. Исследуемые жидкости и эталоны берут
для сравнения в равных количествах. Сравнение производят в
пробирках одинакового стекла и диаметра при дневном отраженном
свете на матово - белом фоне.
Окраска исследуемого образца должна быть вполне идентична
эталону или только приближаться к отмеченной окраске, не превышая
ее по интенсивности, но несколько отличаясь от нее по тону.
Жидкость, которая должна быть бесцветной, рассматривают сверху
через весь слой жидкости на матово - белом фоне. Бесцветными
считают жидкости, которые по цвету не отличаются от воды, а в
случае растворов - от соответствующего растворителя.
Приготовление исходных растворов
Раствор А. Около 6,00 г (точная навеска) растертого хлорида
кобальта (СоCl2 х 6Н2О; М.м. 237,93) растворяют в растворе серной
кислоты (0,1 моль/л) в мерной колбе вместимостью 100 мл,
перемешивают и доводят объем раствора раствором серной кислоты
(0,1 моль/л) до метки.
Содержание хлорида кобальта в растворе определяют следующим
образом: 5 мл раствора хлорида кобальта помещают в коническую
колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют 5 мл 3%
раствора перекиси водорода и 30 мл раствора едкого натра, смесь
кипятят с обратным холодильником в течение 10 мин, затем охлаждают
до комнатной температуры, прибавляют 2 г йодида калия и 15 мл 50%
раствора серной кислоты. Выделившийся йод титруют раствором
тиосульфата натрия (0,1 моль/л) (индикатор - крахмал).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,02379 г хлорида кобальта (II).
Объем раствора хлорида кобальта (СоСl2 х 6Н2О) разбавляют
таким образом, чтобы содержание хлорида кобальта в 1 мл составляло
0,060 г.
Раствор Б. 0,4900 г растертого бихромата калия (К2Сr2О7;
М.м. 294,18) растворяют в растворе серной кислоты (0,1 моль/л) в
мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора
раствором серной кислоты (0,1 моль/л) до метки. 1 мл полученного
раствора должен содержать 0,0049 г бихромата калия (К2Сr2О7).
Содержание бихромата калия в растворе определяют следующим
образом: 20 мл раствора бихромата калия помещают в коническую
колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют 30 мл
разведенной хлористоводородной кислоты, 1 г йодида калия,
оставляют на 5 мин в темном месте, затем прибавляют 80 мл воды и
титруют выделившийся йод раствором тиосульфата натрия (0,1 моль/л)
(индикатор - крахмал) до изменения окраски в зеленый цвет.
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,004903 г бихромата калия.
Раствор В. Около 6,00 г (точная навеска) растертого сульфата
меди (II) (СuSО4 х 5Н2О; М.м. 249,68) растворяют в растворе серной
кислоты (0,1 моль/л) в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят
объем раствора раствором серной кислоты (0,1 моль/л) до метки.
Содержание сульфата меди в растворе определяют следующим
образом: 10 мл раствора сульфата меди помещают в коническую колбу
вместимостью 250 мл с притертой пробкой, прибавляют 40 мл воды, 4
мл разведенной уксусной кислоты, 3 г йодида калия, смесь
перемешивают и выделившийся йод титруют раствором тиосульфата
натрия (0,1 моль/л) (индикатор - крахмал).
Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,02497 г сульфата меди (II). Объем раствора сульфата меди
(CuSО4 х 5H2О) разбавляют таким образом, чтобы содержание сульфата
меди в 1 мл составляло 0,060 г.
Раствор Г. Около 4,50 г (точная навеска) хлорида железа (III)
(FеСl3 х 6Н2О; М.м. 270,30) растворяют в мерной колбе вместимостью
100 мл в растворе серной кислоты (0,1 моль/л) и доводят объем
раствора раствором серной кислоты (0,1 моль/л) до метки.
Содержание хлорида железа (III) в растворе определяют
следующим образом: 10 мл раствора хлорида железа помещают в
коническую колбу вместимостью 250 мл с притертой пробкой,
прибавляют 15 мл разведенной хлористоводородной кислоты, 4 г
йодида калия и оставляют на 15 мин в темном месте. После
прибавления 100 мл воды выделившийся йод титруют раствором
тиосульфата натрия (0,1 моль/л) (индикатор - крахмал).
1 мл раствора тиосульфата натрия (0,1 моль/л) соответствует
0,02703 г хлорида железа (III).
Объем раствора хлорида железа (FеСl3 х 6Н2О) разбавляют таким
образом, чтобы содержание хлорида железа в 1 мл составляло 0,045
г.
Срок годности исходных растворов 1 год.
Приготовление основных растворов
Основные растворы получают смешением исходных растворов
хлорида кобальта (А), бихромата калия (Б), сульфата меди (В) и
хлорида железа (Г) с раствором серной кислоты (0,1 моль/л) в
следующих соотношениях.
Љ””””””””’”””””””’”””””””’”””””””’”””””””’”””””””””””””””””””””””Ї
ЈОсновнойЈРастворЈРастворЈРастворЈРастворЈРаствор серной кислоты Ј
Јраствор ЈА, мл ЈБ, мл ЈВ, мл ЈГ, мл Ј (0,1 моль /л), мл Ј
“””””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””•”””””””””””””””””””””””¤
ЈI Ј35,00 Ј 8,00 Ј17,00 Ј40,00 Ј - Ј
ЈII Ј 9,50 Ј10,70 Ј 1,90 Ј 4,00 Ј 73,90 Ј
ЈIII Ј40,50 Ј 6,30 Ј 6,10 Ј12,00 Ј 35,10 Ј
ЈIV Ј 3,50 Ј10,40 Ј20,10 Ј 4,00 Ј 62,00 Ј
ђ””””””””‘”””””””‘”””””””‘”””””””‘”””””””‘”””””””””””””””””””””””‰
Срок годности основных растворов 1 год.
Приготовление эталонов
Эталоны для сравнения приготавливают из основных растворов
путем разбавления их раствором серной кислоты (0,1 моль/л).
Эталоны следует хранить по 5 мл в бесцветных, герметически
укупоренных пробирках или запаянных ампулах вместимостью 5 мл в
защищенном от света месте.
Срок годности эталонов N 1, 2, 3, 4 - 4 дня. Эталоны N 5, 6, 7
следует применять свежеприготовленными.
Љ”””’””””””””””””””””’””””””””””””””””’””””””””””””””””’””””””””””””””””Ї
ЈН эЈЭталоны коричне-Ј Эталоны желтых ЈЭталоны розовых ЈЭталоны зеленых Ј
Јо тЈвых оттенков Ј оттенков Ј оттенков Ј оттенков Ј
Јм а“””””””””””””””””•””””””””””””””””•””””””””””””””””•””””””””””””””””¤
Је лЈ Ј Ј Ј Ј
Јр оЈ шкала а Ј шкала б Ј шкала в Ј шкала г Ј
Ј нЈ Ј Ј Ј Ј
Ј аЈ Ј Ј Ј Ј
Ј “””””””””’”””””””•””””””””’”””””””•””””””””’”””””””•””””””””’”””””””¤
Ј ЈосновнойЈрастворЈосновнойЈрастворЈосновнойЈрастворЈосновнойЈрастворЈ
Ј Јраствор Јсерной Јраствор Јсерной Јраствор Јсерной Јраствор Јсерной Ј
Ј Ј I, мл ЈкислотыЈII, мл ЈкислотыЈIII, мл ЈкислотыЈIV, мл ЈкислотыЈ
Ј Ј Ј(0,1 Ј Ј(0,1 Ј Ј(0,1 Ј Ј(0,1 Ј
Ј Ј Јмоль/ Ј Јмоль/ Ј Јмоль/ Ј Јмоль/ Ј
Ј Ј Јл), мл Ј Јл), мл Ј Јл), мл Ј Јл), мл Ј
“”””•””””””””•”””””””•””””””””•”””””””•””””””””•”””””””•””””””””•”””””””¤
Ј1. Ј100,00 Ј - Ј100,00 Ј - Ј 100,00 Ј - Ј100,00 Ј - Ј
Ј2 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј 50,00 Ј
Ј3. Ј 25,00 Ј 75,00 Ј 25,00 Ј 75,00 Ј 25,00 Ј 75,00 Ј 25,00 Ј 75,00 Ј
Ј4. Ј 12,50 Ј 87,50 Ј 12,50 Ј 87,50 Ј 12,50 Ј 87,50 Ј 12,50 Ј 87,50 Ј
Ј5. Ј 6,30 Ј 93,70 Ј 6,30 Ј 93,70 Ј 6,30 Ј 93,70 Ј 6,30 Ј 93,70 Ј
Ј6. Ј 3,10 Ј 96,90 Ј 3,10 Ј 96,90 Ј 3,10 Ј 96,90 Ј 3,10 Ј 96,90 Ј
Ј7. Ј 1,60 Ј 98,40 Ј 1,60 Ј 98,40 Ј 1,60 Ј 98,40 Ј 1,60 Ј 98,40 Ј
ђ”””‘””””””””‘”””””””‘””””””””‘”””””””‘””””””””‘”””””””‘””””””””‘”””””””‰
При сравнении окраски испытуемого раствора с эталонами
указывают, кроме номера эталона, букву шкалы. Например, окраска
раствора не должна превышать эталон N 5б.
Примечание. Раствор серной кислоты (0,1 моль/л): медленно и
осторожно, при постоянном перемешивании, вливают 6 мл
концентрированной серной кислоты в 1020 мл воды.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОЗРАЧНОСТИ И СТЕПЕНИ
МУТНОСТИ ЖИДКОСТЕЙ
Прозрачность и степень мутности жидкостей определяют путем
сравнения испытуемой жидкости с растворителем или эталонами.
Испытание проводят при освещении электрической лампой матового
стекла мощностью 40 Вт на черном фоне при вертикальном
расположении пробирок (рис. 21) <*>.
--------------------------------
<*> Рис. 21. Схема просмотра прозрачности и степени мутности
жидкостей: 1 - источник света; 2 - экран; 3 - зона контроля; 4 -
глаза. (Рисунок не приводится).
Жидкость считают прозрачной, если при ее рассмотрении
невооруженным глазом не наблюдается присутствие нерастворенных
частиц, кроме единичных волокон. Сравнение проводят с
растворителем, взятым для приготовления жидкостей.
Эталонами для определения степени мутности служат взвеси из
гидразина сульфата и гексаметилентетрамина.
I. Приготовление раствора гидразина сульфата. 0,50 г гидразина
сульфата (ГОСТ 5841-74, ч.д.а.) помещают в мерную колбу
вместимостью 50 мл, растворяют в 40 мл воды, перемешивают, доводят
объем раствора водой до метки и оставляют на 6 ч.
II. Приготовление раствора гексаметилентетрамина. 3,00 г
гексаметилентетрамина растворяют в 30 мл воды, взятых пипеткой или
бюреткой.
III. Приготовление исходного эталона. К 25 мл раствора
гидразина сульфата прибавляют 25 мл раствора
гексаметилентетрамина, тщательно перемешивают и оставляют на 24 ч.
Растворы гидразина сульфата и гексаметилентетрамина берут пипеткой
или бюреткой.
Срок годности исходного эталона 2 мес в склянках с притертыми
пробками.
Примечание. Перед применением исходный эталон, основной эталон
и эталонные растворы следует тщательно перемешать в течение 3 мин.
IV. Приготовление основного эталона. 15 мл исходного эталона,
взятого пипеткой, помещают в мерную колбу вместимостью 1 л,
доводят объем жидкости водой до метки и перемешивают.
Срок годности основного эталона 24 ч.
V. Приготовление эталонных растворов. Для приготовления
эталонных растворов I, II, III, IV основной эталон берут пипеткой
или бюреткой в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем
жидкости водой до метки.
Љ”””””””””””””””””””’””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””””Ї
Ј Ј Эталонные растворы Ј
“”””””””””””””””””””•”””””””””’””””””””””’”””””””””””’”””””””””””¤
Ј Ј I Ј II Ј III Ј IV Ј
Ј “”””””””””•””””””””””•”””””””””””•”””””””””””¤
ЈОсновной эталон, млЈ 5 Ј 10 Ј 30 Ј 50 Ј
ЈВода, мл Ј 95 Ј 90 Ј 70 Ј 50 Ј
ђ”””””””””””””””””””‘”””””””””‘””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‰
Эталонные растворы I, II, III, IV должны быть
свежеприготовленными.
Для сравнения берут равные объемы эталонного раствора и
испытуемой жидкости (5 или 10 мл). Сравнение проводят в пробирках
бесцветного стекла или стекла одинакового оттенка, одного и того
же диаметра с притертыми пробками.
Определение степени мутности окрашенных жидкостей производят в
компараторе. Часть испытуемой жидкости фильтруют через бумажный
фильтр; в компараторе помещают рядом пробирки с фильтрованной и
нефильтрованной жидкостями; позади пробирки с нефильтрованной
жидкостью ставят пробирку с растворителем, позади пробирки с
фильтрованной жидкостью помещают последовательно пробирки с
соответствующими эталонами мутности до появления мути, сходной с
мутью нефильтрованной жидкости. Пробирки просматривают при
подсвечивании электрической лампой 40 Вт.
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ХИМИЧЕСКОГО
ЭКСПЕРИМЕНТА И БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ
В настоящей статье для предпочтительного использования приняты
следующие обозначения:
А - измеряемая величина;
а - свободный член линейной зависимости;
b - угловой коэффициент линейной зависимости;
0
D , D - доза стандартного и испытуемого препаратов;
F - критерий Фишера;
f - число степеней свободы;
i - порядковый номер варианты;
L - фактор, используемый при оценке сходимости
результатов параллельных определений;
m, n - объемы выборки;
_
Р, Р - доверительная вероятность соответственно при
дву- и односторонней постановке задачи;
Q1, Qn - контрольные критерии для индентификации грубых
ошибок;
R - размах варьирования;
r - коэффициент корреляции;
s - стандартное отклонение;
2
s - дисперсия;
s_ - стандартное отклонение среднего результата;
х
s - логарифмическое стандартное отклонение;
lg
2
s - логарифмическая дисперсия;
lg
s _ - логарифмическое стандартное отклонение среднего
lg x результата;
g
2 2 2
s , s , s - общая дисперсия и дисперсия коэффициентов
0 b а линейной зависимости;
t - критерий Стьюдента;
U - коэффициент для расчета границ среднего
результата гарантии качества анализируемого
продукта;
W - весовой коэффициент пробита;
х, y - текущий координаты в уравнении линейной
зависимости;
_
Y - активность препарата;
Xi, Yi - вычисленные, исходя из уравнения линейной
зависимости значения переменных х и у;
Y - пробит;
_ _
х, y - средние выборки (координаты центра линейной
зависимости);
х , y - i-тая варианта (i-тая пара экспериментальных
i i значений х и у);
_ _
х +/-"ДЕЛЬТА"х - граничные значения доверительного интервала
среднего результата;
х +/-"ДЕЛЬТА"х - граничные значения доверительного интервала
i результата отдельного определения;
"ДЕЛЬТА" - разность некоторых величин;
"альфа" - уровень значимости, степень надежности;
"ДЕЛЬТА"х - полуширина доверительного интервала величины;
"дельта" - относительная величина систематической ошибки;
"эпсилон", - относительные ошибки соответственно результата
_______ отдельного определения и среднего результата;
"эпсилон"
"ми" - истинное значение измеряемой величины;
SUM - знак суммирования (сумма);
2
"хи" - критерий хи - квадрат.
I. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА
РЕЗУЛЬТАТОВ ХИМИЧЕСКОГО ЭКСПЕРИМЕНТА
Метрологические характеристики методов и результатов,
получаемых при статистической обработке данных эксперимента,
позволяют проводить оценку и сравнение как экспериментальных
методик, так и изучаемых объектов и на этой основе решать ряд
прикладных задач, связанных с определением статистической
достоверности результатов исследования.
I.1. ОСНОВНЫЕ СТАТИСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ОДНОРОДНОЙ ВЫБОРКИ И ИХ ВЫЧИСЛЕНИЕ
Проверка однородности выборки. Исключение выпадающих значений
вариант. Термином "выборка" обозначают совокупность статистически
эквивалентных результатов (вариант). В качестве такой совокупности
можно, например, рассматривать ряд результатов, полученных при
параллельных определениях содержания какого-либо вещества в
однородной по составу пробе.
Допустим, что отдельные значения вариант выборки объема n
обозначены через х (1 <= i <= n) и расположены в порядке
возрастания: i
х ; х ; ... х ; ... х ; х , (I.1.1)
1 2 i n - 1 n
Результаты, полученные при статистической обработке выборки,
будут достоверны лишь в том случае, если эта выборка однородна,
т.е. если варианты, входящие в нее, не отягощены грубыми ошибками,
допущенными при измерении или расчете. Такие варианты должны быть
исключены из выборки перед окончательным вычислением ее
статистических характеристик. Для выборки небольшого объема (n <
10) идентификация вариант, отягощенных грубыми ошибками, может
быть выполнена, исходя из величины размаха варьирования R
(см. уравнения I.1.12, I.1.13 а, б). Для идентификации таких
вариант в выборке большого объема (n >= 10) целесообразно
проводить предварительную статистическую обработку всей выборки,
полагая ее однородной, и уже затем на основании найденных
статистических характеристик решать вопрос о справедливости
сделанного предположения об однородности (см. выражение I.1.14).
_
В большинстве случаев среднее выборки х является наилучшей
оценкой истинного значения измеряемой величины "ми", если его
вычисляют как среднее арифметическое всех вариант:
n
SUM х
_ 1 i
х = --------- (I.1.2)
n
_
При этом разброс вариант х , вокруг среднего х характеризуется
i
величиной стандартного отклонения s. В количественном химическом
анализе величина s часто рассматривается как оценка случайной
ошибки, свойственной данному методу анализа. Квадрат этой величины
2
s называют дисперсией. Величина дисперсии может рассматриваться
как мера воспроизводимости результатов, представленных в данной
2
выборке. Вычисление величин s и s проводят по уравнениям I.1.5 и
I.1.6. Иногда для этого предварительно определяют значения
отклонений d и число степеней свободы (число независимых
i
вариант) f:
_
d = х - х ; (I.1.3.)
i i
f = n - l; (I.1.4.)
n 2 n 2 - 2
SUM d SUM х - nх
2 1 i 1 i
s = --------- = ---------------; (I.1.5.)
f f
----
/ 2
s = / s . (I.1.6.)
Стандартное отклонение среднего результата S_ рассчитывают по
по уравнению: х
s
s_ = -------. (I.1.9.)
х ---
/ n
Примечание I.1.1. При наличии ряда из g выборок с порядковыми
2
номерами k (l <= k <= g) расчет дисперсии s целесообразно
проводить по формуле:
i=n Љ i=n Ї
k=g k 2 k=g 2 k=g Ј k 2 _2 Ј
SUM SUM d SUM [(n - 1) s ] SUM Ј SUM х - n х Ј
2 k=1 i=1 ik k=1 k k k=1 ђ i=1 ik k k ‰
s = ------------- х ----------------- = ------------------------
f f f
(I.1.7.)
При этом число степеней свободы равно:
k=g
f = SUM (n - 1). (I.1.8.)
k=1 k
где х - среднее k - той выборки; n - число вариант в k-той
k k
2
выборке; х - i-тая варианта k-той выборки; s - дисперсия k-той
ik k
выборки; d - отклонение i-той варианты k-той выборки.
ik
Необходимым условием применения уравнений I.1.7 и I.1.8
является отсутствие статистически достоверной разницы между
2
отдельными значениями s . В простейшем случае сравнение крайних
k
2
значений s проводят, исходя из величины критерия F, которую
k
вычисляют по уравнению I.3.4 и интерпретируют, как указано в
разделе I.3.
Примечание I.1.2. Если при измерениях получают логарифмы
искомых вариант, среднее выборки вычисляют как среднее
геометрическое, используя логарифм вариант:
n
SUM lg х
_ 1 i
lg х = ------------ , (I.1.10)
g n
откуда
_ ------------ _
х = n / х1х2... х = antilg (lg х ). (I.1.11)
g / n g
2
Значения s , s и s_ в этом случае также рассчитывают,
х
исходя из логарифмов вариант, и обозначают соответственно через
2 _
s , s и s х .
lg lg lg g
Пример I.1.1. При определении содержания стрептоцида в образце
линимента были получены следующие данные.
Љ”””””””””””””””””’””””””””’””””””””’””””””””’””””””””’””””””””””Ї
Ј Номер опыта i Ј 1 Ј 2 Ј 3 Ј 4 Ј 5 Ј
“”””””””””””””””””•””””””””•””””””””•””””””””•””””””””•””””””””””¤
Ј х , % Ј 9,52 Ј 9,55 Ј 9,83 Ј 10,12 Ј 10,33 Ј
Ј i Ј Ј Ј Ј Ј Ј
ђ”””””””””””””””””‘””””””””‘””””””””‘””””””””‘””””””””‘””””””””””‰
n = 5; f = n - 1 = 5 - 1 = 4
n
SUM х 9,52 + 9,55 + 9,83 + 10,12 + 10,33
1 i
х = ------- = ---------------------------------- = 9,87.
n 5
_
d = Јx - xЈ = Јx - 9,87Ј, т.е. d1 = Ј9,52 - 9,87Ј = 0,35 и т.д.
i i i
n n 2 _2
SUM d SUM х - nх
2 1 i 1 i
s = ------- = ------------- =
f f
2 2 2 2 2 2
(9,52 + 9,55 + 9,83 + 10,12 + 10,33 ) - 5 х 9,87
= ----------------------------------------------------- = 0,1252;
4
---
/ 2 -------
s = / s = / 0,1252 = 0,3538;
s 0,3538
s_ = ------- = ------- = 0,1582.
х ---- ----
/ n / 5
2
Как было указано выше, значения х, s , s и s_ могут быть
х
признаны достоверными, если ни одна из вариант выборки не
отягощена грубой ошибкой, т. е. если выборка однородна. Проверка
однородности выборок малого объема (n < 10) осуществляется без
предварительного вычисления статистических характеристик, с этой
целью после представления выборки в виде I.1.1 для крайних вариант
х1 и x рассчитывают значения контрольного критерия Q, исходя из
n
величины размаха варьирования R:
R = [х1 - х ]; (I.1.12)
n
[х1 - х2]
Q1 = ----------; (I.1.13a)
R
[х - х ]
n n - 1
Qn = -------------; (I.1.13б)
R
Выборка признается неоднородной, если хотя бы одно из
_
вычисленных значений Q превышает табличное значение Q (Р, n),
_
найденное для доверительной вероятности Р (см. табл. 1
приложения). Варианты х1 или х , для которых соответствующее
n
_
значение Q > Q (P, n), отбрасываются, и для полученной выборки
уменьшенного объема выполняют новый цикл вычислений по уравнениям
I.1.12 и I.1.13 с целью проверки ее однородности. Полученная в
конечном счете однородная выборка используется для вычисления х,
2
s , s и s_.
х
Примечание I.1.3. При Јх1 - х2Ј < Јх2 - х3Ј и Јх - х Ј <
Ј n n - 1Ј
Јх - х Ј уравнения I.1.13 а и I.1.13 б принимают
Ј n - 1 n - 2Ј
соответственно вид:
Јх - х Ј
Јх2 - х3Ј Ј n - 1 n - 2Ј
Q1 = ------------; Qn = -----------------.
R R
Пример I.1.2. При проведении девяти (n = 9) определений
содержания общего азота в плазме крови крыс были получены
следующие данные (в порядке возрастания):
Љ””””””’””””””’””””””’””””””’””””””’””””””’”””””’”””””’”””””’””””Ї
Ј i Ј 1 Ј 2 Ј 3 Ј 4 Ј 5 Ј 6 Ј 7 Ј 8 Ј 9 Ј
“””””””•””””””•””””””•””””””•””””””•””””””•”””””•”””””•”””””•””””¤
Ј х ,% Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј i Ј 0,62 Ј 0,81 Ј 0,83 Ј 0,86 Ј 0,87 Ј0,90 Ј0,94 Ј0,98 Ј0,99Ј
ђ””””””‘””””””‘””””””‘””””””‘””””””‘””””””‘”””””‘”””””‘”””””‘””””‰
По уравнениям I.1.12 и I.1.13а находим:
R = Јх1 - х Ј = Ј0,62 - 0,99Ј = 0,37;
n
Јх1 - х2Ј Ј0,62 - 0,81Ј
Q1 = --------------- = ------------- = 0,51.
R 0,37
По таблице 1 приложения находим:
Q(9; 95%) = 0,46 < Q1 = 0,51;
Q(9; 99%) = 0,55 > Q1 = 0,51.
Следовательно, гипотеза о том, что значение х1 = 0,62 должно
быть исключено из рассматриваемой совокупности результатов
измерений как отягощенное грубой ошибкой, может быть принята с
доверительной вероятностью 95%, но должна быть отвергнута, если
выбранное значение доверительной вероятности равно 99%.
Для выборок большого объема (n >= 10) проверку однородности
проводят после предварительного вычисления статистических
_ 2
характеристик х, s , s и s_. При этом выборка признается
х
однородной, если для всех вариант выполняется условие:
ЈdiЈ <= Ј3sЈ. (I.1.14)
Если выборка признана неоднородной, то варианты, для которых
Јdi Ј > 3s, отбрасываются, как отягощенные грубыми ошибками с
доверительной вероятностью Р > 99,0%. В этом случае для полученной
выборки сокращенного объема повторяют цикл вычислений
статистических характеристик по уравнениям I.1.2, I.1.5, I.1.6,
I.1.9 и снова проводят проверку однородности. Вычисление
статистических характеристик считают законченным, когда выборка
сокращенного объема оказывается однородной.
Примечание I.1.4. При решении вопроса об однородности
конкретной выборки небольшого объема также можно воспользоваться
выражением I.1.14, если известна оценка величины s, ранее
найденная для данного метода измерения (расчета) вариант.
I.2. ДОВЕРИТЕЛЬНЫЕ ИНТЕРВАЛЫ И ОЦЕНКА ИХ ВЕЛИЧИНЫ
Если случайная однородная выборка конечного объема n получена
в результате последовательных измерений некоторой величины А,
_
имеющей истинное значение "ми", то среднее этой выборки х следует
рассматривать лишь как приближенную оценку А. Достоверность этой
_
оценки характеризуется величиной доверительного интервала х +/-
_
"ЕЛЬТА"х, для которой с заданной доверительной вероятностью Р
выполняется условие:
_ _ _ _
(х - "ДЕЛЬТА"х) <= "ми" <= (х + "ДЕЛЬТА"х). (I.2.1)
Расчет граничных значений доверительного интервала проводят по
Стьюденту, предполагая, что варианты, входящие в выборку,
распределены нормально:
_ _ _ t(P,f)s
(х +/- "ДЕЛЬТА"х) = х +/- ----------- (I.2.2)
---
/ n
Здесь t(P, f) - табличное значение критерия Стьюдента (см.
таблицу II приложения).
Если при измерении одним и тем же методом двух близких
значений А были получены две случайные однородные выборки с
объемами n и m, то при m < n для выборки объема m справедливо
выражение:
_ _ _ t(P,f(n))S(n)
х +/- "ДЕЛЬТА"х = х +/- --------------- (I.2.3)
(m) (m) (m) ----
/ m
(индекс указывает принадлежность величин к выборке объема m или
n).
Выражение I.2.3 позволяет оценить величину доверительного
_
интервала среднего х(m), найденного, исходя из выборки объема m.
_
Иными словами, доверительный интервал среднего х(m) выборки
относительно малого объема m может быть сужен благодаря
использованию известных величин s(n) и t(P, f(n)), найденных
ранее для выборки большего объема n (в дальнейшем индекс n будет
опущен).
m + n
Примечание I.2.1. Если n <= 15, а ----- > 1,5, величины s и f
n
целесообразно вычислять, как указано в примечании I.1.1.
Подставляя n = 1 в выражение I.2.2 или m = 1 в выражение
I.2.3, получаем:
х +/- "ДЕЛЬТА"х = х +/- t(P, f)s. (I.2.4)
i i
Этот интервал является доверительным интервалом результата
отдельного определения. Для него с доверительной вероятностью Р
выполняются взаимосвязанные условия:
х - "ДЕЛЬТА"х <= "ми" <= х + "ДЕЛЬТА"х ; (I.2.5)
i i
"ми" - "ДЕЛЬТА"х <= х <= "ми" + "ДЕЛЬТА"х ; (I.2.6)
i
_
Значения "ДЕЛЬТА"x и "ДЕЛЬТА"х из выражений I.2.2 и I.2.4
используют при вычислении относительных погрешностей отдельной
_________
варианты ("эпсилон") и среднего результата ("эпсилон"), выражая
эти величины в %:
"ДЕЛЬТА"х
"эпсилон" = --------- 100% (I.2.7)
_
х
_
_______ "ДЕЛЬТА"х
"эпсилон" = -------- 100% (I.2.8)
_
х
Пример I.2.1. В результате определения содержания хинона в
стандартном образце хингидрона были получены следующие данные (n =
10).
Љ””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””’”””””Ї
Ј i Ј 1 Ј 2 Ј 3 Ј 4 Ј 5 Ј 6 Ј 7 Ј 8 Ј 9 Ј 10 Ј
“””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””•”””””¤
Јхi,%Ј49,80Ј49,83Ј49,87Ј49,87Ј49,92Ј50,01Ј50,05Ј50,06Ј50,10Ј50,11Ј
ђ””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‘”””””‰
Расчеты по формуле I.1.2, I.1.4, I.1.5, I.1.6, I.1.9 дали
следующие результаты:
_ 2
х = 49,96; f = 9; s = 0,01366; s = 0,1169; s_ = 0,03696.
х
Доверительные интервалы результата отдельного определения и
среднего результата при Р=90% получаем согласно I.2.4 и I.2.2:
x +/- "ДЕЛЬТА"x = х +/- t(P,f)s = х +/- t(90%, 9)s =
i i i
= x +/- 1,83 х 0,1169 = х +/- 0,21;
i i
_ _ _ t(P,f)s 1,83 х 0,1169
x +/- "ДЕЛЬТА"x = х +/- ---------- = 49,96 +/- ------------- =
---- ----
/ n / 10
= 49,96 +/- 0,07
_______
Тогда относительные погрешности "эпсилон" и "эпсилон",
согласно I.2.7 и I.2.8, равны:
"ДЕЛЬТА"х 0,21
"эпсилон" = --------- 100% = ------ х 100% = 0,42%;
_ 49,96
х
_
_______ "ДЕЛЬТА"х 0,07
"эпсилон" = --------- 100% = ------ х 100% = 0,14%.
_ 49,96
х
Обозначая истинное содержание хинона в хингидроне через "ми",
можно считать, что с 90% доверительной вероятностью справедливы
неравенства:
"ми" - 0,21 <= х <= "ми" + 0,21;
i
х - 0,21 <= "ми" <= х + 0,21 (при любом i);
i i
_ _ _
"ми" - 0,07 <= х <= "ми" + 0,07; х - 0,07 <= "ми" <= х + 0,07
(при n = 10).
Примечание I.2.2. Вычисление доверительных интервалов для
случая, описанного в примечании I.1.2, проводят, исходя из
логарифмов вариант. Тогда выражения I.2.2 и I.2.4 принимают вид:
t(P,f)s
_ _ _ lg
lg х +/- "ДЕЛЬТА"lg х = lg х +/- ------------; (I.2.9)
---
/ n
lg х +/- "ДЕЛЬТА"lg х = lg x +/- t(P,f)s . (I.2.10)
i i lg
Потенцирование выражений I.2.9 и I.2.10 приводит к
_
несимметричным доверительным интервалам для значений х и х :
i
_ _ _ _ _
antilg(lg x - "ДЕЛЬТА"lg х) <= х <= antilg(lg х + "ДЕЛЬТА"lg х);
(I.2.11)
antilg(lg x - "ДЕЛЬТА"lg х ) <= х <= antilg(lg х + "ДЕЛЬТА"lg х ).
i i i i i
(I.2.12)
где
t(p,f)s
_ lg
"ДЕЛЬТА"lg х = -------------;
---
/ n
"ДЕЛЬТА"lg х = t(P,f)s .
i lg
При этом для нижних и верхних границ доверительных интервалов
_
х и х имеем:
Љ Ї
ЈЈ _ _ _Ј Ј
_______ ЈЈantilg(lg x +/- "ДЕЛЬТА"lg х) - хЈ Ј
"эпсилон" =Ј------------------------------------Ј 100%; (I.2.12а)
Ј _ Ј
Ј х Ј
ђ ‰
Љ Ї
ЈЈаntilg(lg x +/- "ДЕЛЬТА"lg х) - х Ј Ј
ЈЈ i iЈ Ј
"эпсилон" =Ј-------------------------------------Ј 100%. (I.2.12б)
Ј x Ј
Ј i Ј
ђ ‰
I.3. МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА АНАЛИЗА.
СРАВНЕНИЕ ДВУХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА ПО ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
С целью получения метрологической характеристики метода
проводят совместную статистическую обработку одной или нескольких
выборок, полученных при анализе образцов с известным содержанием
определяемого компонента "ми". Результаты статистической обработки
представляют в виде табл. I.3.1.
Таблица I.3.1
Метрологические характеристики метода анализа
Љ””””’”””’”””””’””””’””””’”””’””””””’”””””””””’”””””””””’””””””””Ї
Ј Ј Ј _ Ј 2 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј"ми"Ј f Ј х Ј s Ј s Ј Р Јt(P,f)Ј"ДЕЛЬТА"хЈ"эпсилон"Ј"дельта"Ј
“””””•”””•”””””•””””•””””•”””•””””””•”””””””””•”””””””””•””””””””¤
Ј 1 Ј 2 Ј 3 Ј 4 Ј 5 Ј 6 Ј 7 Ј 8 Ј 9 Ј 10 <*> Ј
“””””•”””•”””””•””””•””””•”””•””””””•”””””””””•”””””””””•””””””””¤
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
ђ””””‘”””‘”””””‘””””‘””””‘”””‘””””””‘”””””””””‘”””””””””‘””””””””‰
--------------------------------
<*> Графа 10 заполняется в том случае, если реализуется
неравенство I.3.2.
Примечание I.3.1. При проведении совместной статистической
обработки нескольких выборок, полученных при анализе образцов с
разным содержанием определяемого компонента "ми", данные в графах
1, 2, 3, 4, 9 и 10 табл. I.3.1 приводят отдельно для каждой
выборки. При этом в графах 2, 4, 5, 7, 8 в последней строке под
2
чертой приводят обобщенные значения f, s , s, t, "ДЕЛЬТА"x,
вычисленные с учетом примечания I.1.1.
_
Если для выборки объема m величина Ј"ми" - хЈ > 0, следует
решить вопрос о наличии или отсутствии систематической ошибки. Для
этого вычисляют критерий Стьюдента t:
_ ---
Ј"ми" - хЈ / m
t = ------------------- . (I.3.1.)
s
Если, например, при Р = 95% и f = m - 1, реализуется неравенство
t > t(P, f), (I.3.2)
полученные данным методом результаты отягощены систематической
ошибкой, относительная величина которой "дельта" вычисляется по
формуле:
_
х - "ми"
"дельта" = -------- 100%. (I.3.3)
"ми"
_
Следует помнить, что если величина А определена как среднее х
некоей выборки, полученной эталонным методом, критерий Стьюдента t
может рассчитываться по уравнению I.4.5.
При сравнении воспроизводимости двух методов анализа с
2 2 2 2
оценками дисперсий s1 и s2 (s1 > s2) вычисляют критерий Фишера F:
2
s1
F = -----. (I.3.4)
2
s2
2 2
Критерий F характеризует при s1 > s2 достоверность различия
2 2
между s1 > s2.
Вычисленное значение F сравнивают с табличным значением
F(P, f1, f2), найденным при Р = 99% (см. таблицу III приложения).
Если
F > F(P, f1, f2), (I.3.5)
2 2
различие дисперсий s1 и s2 признается статистически значимым с
вероятностью Р, что позволяет сделать заключение о более высокой
воспроизводимости второго метода. При
F <= F(P, f1, f2) (I.3.5а)
2 2
различие значений s1 и s2 не может быть признано значимым и
заключение о различии воспроизводимости методов сделать нельзя
ввиду недостаточного объема информации.
Примечание I.3.2. Для случая, описанного в примечании I.1.2, в
_ 2
табл. I.3.1 вместо величин "ми", х, s1 и s приводят величины
_ 2
lg "ми", lg х , s и s . При этом в графу 8, согласно
g lg lg
примечанию I.2.2, вносят величину "ДЕЛЬТА"lg х, а в графу 9 -
максимальное по абсолютной величине значение "эпсилон".
Аналогичные замены проводят при вычислении t по уравнению I.3.1 и
F - по уравнению I.3.4.
Для сравнения двух методов анализа результаты статистической
обработки сводят в табл. I.3.2.
Таблица I.3.2
Данные для сравнительной метрологической оценки
двух методов анализа
Љ””””’””””’”’”’””’”’”’”””””””’””””””’””””””’””””’””””””””””’””””’””””””’””””Ї
ЈMe- Ј Ј Ј_Ј 2Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј ЈПри-Ј
Јтод,Ј"ми"ЈfЈхЈs ЈsЈРЈt(Р, f)Ј"ДЕЛЬ-Ј"эпси-Јt ЈF(Р,f1,f2)ЈF Ј"дель-Јме- Ј
ЈN Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј(табл.)ЈТА"х Јлон" Ј вычЈ (табл.) Ј вычЈта" Јча- Ј
Јп/п Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Р - 99% Ј Ј Јния Ј
“””””•””””•”•”•””•”•”•”””””””•””””””•””””””•””””•””””””””””•””””•””””””•””””¤
Ј 1 Ј 2 Ј3Ј4Ј5 Ј6Ј7Ј 8 Ј 9 Ј 10 Ј 11 Ј 12 Ј 13 Ј 14 Ј 15 Ј
“””””•””””•”•”•””•”•”•”””””””•””””””•””””””•””””•””””””””””•””””•””””””•””””¤
Ј 1 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј 2 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
ђ””””‘””””‘”‘”‘””‘”‘”‘”””””””‘””””””‘””””””‘””””‘””””””””””‘””””‘””””””‘””””‰
Метрологическое сравнение методов анализа желательно проводить
при "ми1" = "ми2", f1 > 10 и f2 > 10. Если точные значения "ми1" и
"ми2" неизвестны, величины "дельта" и t не определяют.
выч
Пример I.3.1. Пусть для двух выборок аналитических данных (1 и
2), характеризующих, например, различные методы анализа, получены
метрологические характеристики, приведенные в графах 1-10 табл.
I.3.3.
Таблица I.3.3
Љ””””’””””’””’””””””’”””””’”””””’””’”””””””’””””””’””””’”””””’”””””””””””’”””””’””””””Ї
ЈНо- Ј Ј Ј _ Ј 2 Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Јмер Ј"ми"Јf Ј х, % Ј s Ј s ЈР,Јt(Р, f)Ј"ДЕЛЬ-Ј"эп-Јt ЈF(Р,f1,f2) ЈF Ј"дель-Ј
Јвы- Ј Ј Ј Ј Ј Ј% Ј(табл.)ЈТА"х Јси- Ј выч Ј (табл.) Ј выч Јта" Ј
Јбор-Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Јлон"Ј Ј Р = 99% Ј Ј Ј
Јки Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
“””””•””””•””•””””””•”””””•”””””•””•”””””””•””””””•””””•”””””•”””””””””””•”””””•””””””¤
Ј 1 Ј 2 Ј3 Ј 4 Ј 5 Ј 6 Ј7 Ј 8 Ј 9 Ј10 Ј 11 Ј 12 Ј 13 Ј 14 Ј
“””””•””””•””•””””””•”””””•”””””•””•”””””””•””””””•””””•”””””•”””””””””””•”””””•””””””¤
Ј 1 Ј100 Ј20Ј100,13Ј0,215Ј0,464Ј95Ј 2,09 Ј 0,97 Ј0,97Ј1,28 Ј Ј Ј - Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј 3,36 Ј17,92Ј Ј
Ј 2 Ј100 Ј15Ј98,01 Ј0,012Ј0,110Ј95Ј 2,13 Ј 0,23 Ј0,24Ј72,36Ј Ј Ј 1,99 Ј
ђ””””‘””””‘””‘””””””‘”””””‘”””””‘””‘”””””””‘””””””‘””””‘”””””‘”””””””””””‘”””””‘””””””‰
Для заполнения графы 11 вычислим значения t1 и t2:
_ --- ------
Ј"ми" - х1Ј / m1 Ј100 - 100,13Ј /20 + 1
t1 = -------------------- = ------------------------- = 1,28;
s1 0,464
_ ---- ------
Ј"ми" - х2Ј / m2 Ј100 - 98,01Ј /15 + 1
t2 = --------------------- = ----------------------- = 72,36;
s2 0,110
_
Поскольку t1 = 1,28 < (95%, 20) = 2,09, гипотеза Ј"ми1" - x1Ј
не равно 0 может быть отвергнута, что позволяет считать результаты
выборки 1 свободными от систематической ошибки.
Напротив, поскольку t2 = 72,36 >> t2 (95%, 15) = 2,13,
_
гипотезу Ј"ми2" - x2 Ј не равно 0 приходится признать
статистически достоверной, что свидетельствует о наличии
систематической ошибки в результатах выборки 2. В графу 14 вносим:
_
Ј"ми1" - x1Ј Ј100 - 98,01Ј
"дельта2" = ------------ 100% = ------------- х 100% = 1,99%.
"ми" 100
Заполним графы 12 и 13:
F(99%; 20; 15) = 3,36;
2
s1 0,215
F = ---- = ----- = 17,92;
2 0,012
s2
F = 17,92 >> f(99%; 20; 15) = 3,36.
2
Следовательно, при Р = 99% гипотезу о различии дисперсий s1 и
2
s2 следует признать статистически достоверной.
Выводы:
а) результаты, полученные первым методом, являются
правильными, т.е. они не отягощены систематической ошибкой;
б) результаты, полученные вторым методом, отягощены
систематической ошибкой;
в) по воспроизводимости второй метод существенно лучше первого
метода.
I.4. МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ
ХАРАКТЕРИСТИКА СРЕДНЕГО РЕЗУЛЬТАТА.
СРАВНЕНИЕ СРЕДНИХ РЕЗУЛЬТАТОВ ДВУХ ВЫБОРОК
Если с помощью данного метода анализа (измерения) следует
определить значение некоторой величины А, то для полученной
экспериментально однородной выборки объема m рассчитывают
величины, необходимые для заполнения табл. I.4.1. Так поступают в
том случае, если применяемый метод анализа (измерения) не был
ранее аттестован метрологически. Если же этот метод уже имеет
метрологическую аттестацию, графы 2, 4, 5, 7, 8 и 9 табл. I.4.1
заполняются на основании данных табл. I.3.1, полученных при
аттестации. При заполнении табл. I.4.1. следует при необходимости
учитывать примечания I.2.1 и I.3.1.
Таблица I.4.1
Метрологические характеристики среднего результата
Љ””’”’”””’””’”””’””’”’””””””””’”””””””””’””””””””””””””’”””””””””Ї
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј _ Ј Ј
Ј Ј Ј _ Ј 2Ј Јs_Ј Ј Ј Ј"ДЕЛЬТА"х или Ј _______ Ј
Јm ЈfЈ х Јs Ј s Ј хЈPЈt (P, f)Ј"ДЕЛЬТА"хЈ_ _Ј"эпсилон"Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Јх +/-"ДЕЛЬТА"хЈ Ј
“””•”•”””•””•”””•””•”•””””””””•”””””””””•””””””””””””””•”””””””””¤
Ј1 Ј2Ј 3 Ј 4Ј 5 Ј 6Ј7Ј 8 Ј 9 Ј 10 Ј 11 Ј
“””•”•”””•””•”””•””•”•””””””””•”””””””””•””””””””””””””•”””””””””¤
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј
ђ””‘”‘”””‘””‘”””‘””‘”‘””””””””‘”””””””””‘””””””””””””””‘”””””””””‰
Таким образом, на основании выражения I.2.1 для измеряемой
величины А в предположении отсутствия систематической ошибки с
вероятностью Р выполняется условие:
_ _ _ _
х - "ДЕЛЬТА"х <= А <= х + "ДЕЛЬТА"х, (I.4.1)
т. е.
_ _ _
А = х +/- "ДЕЛЬТА"х. (I.4.2)
Примечание I.4.1. В случае, предусмотренном в примечании
_
I.1.2, в графе 9 табл. I.4.1 приводят величину "ДЕЛЬТА"lg x, а
каждую из граф 3, 10 и 11 разбивают на две (а, б). В графе 3а
_ _
приводят значение х , в графе 3б - значение lg х , в графах 10а
g g
и 10б - соответственно значения нижней и верхней границ
_
доверительного интервала для х (см. уравнения I.2.11, I.2.12).
g
Наконец, в графе 11 приводят максимальное по абсолютной величине
_______
значение "эпсилон", (см. уравнение I.2.12а).
Если в результате измерений одной и той же величины А получены
_ _
две выборки объема n1 и n2, причем х1 не равно х2, может
возникнуть необходимость проверки статистической достоверности
гипотезы:
_ _
х1 = х2, (I.4.3)
_ _
т.е. значимости разности (х1 - х2).
Такая проверка необходима, если величина А определялась двумя
разными методами с целью их сравнения или если величина А
определялась одним и тем же методом для двух разных объектов,
идентичность которых требуется доказать. Для проверки гипотезы
I.4.3 следует установить, существует ли статистически значимое
2 2
различие между дисперсиями s1 и s2. Эта проверка проводится так,
как указано в разделе I.3 (см. выражения I.3.4, I.3.5, I.3.5а).
Рассмотрим три случая.
2 2
1. Различие дисперсий s1 и s2 статистически недостоверно
(справедливо неравенство I.3.5а). В этом случае средневзвешенное
2 2
значение s вычисляют по уравнению I.1.7, а дисперсию s разности
_ _ Р
Јx1 - х2Ј - по уравнению I.4.4:
2
2 s (n1 + n2)
s = ------------ ; (I.4.4)
Р n1n2
----
/ 2
s = / s (I.4.4a)
Р / Р .
Далее вычисляют критерий Стьюдента:
_ _ _ ---------
Јх1 - х2Ј Јх1 - х2Ј / n1n2
t = ---------- = ---------- / ---------; (I.4.5)
s s / n1 + n2
Р
f = n1 + n2 - 2. (I.4.5а)
Если при выбранном значении Р (например, при Р = 95%)
t > t(Р, f), (I.4.6)
_ _
то результат проверки положителен - значение (х1 - х2) является
_ _
значимым и гипотезу х1 = х2 отбрасывают. В противном случае надо
признать, что эта гипотеза не противоречит экспериментальным
данным. 2 2
2. Различие значений s1 и s2 статистически достоверно
2 2 2
(справедливо неравенство I.3.5). Если s1 > s2, дисперсию s
Р
_ _
разности (х1 - х2) находят по уравнению I.4.7, а число степеней
свободы f- по уравнению I.4.8:
2 2
2 s1 s2
s = ---- + ---- ; (I.4.7)
Р n1 n2
Љ Ї
Ј 2 2 Ј
Ј s1s2 Ј
f = (n1 + n2 - 2) Ј 0,5 + -------- Ј. (I.4.8)
Ј 4 4 Ј
Ј s1 + s2 Ј
ђ ‰
Следовательно, в данном случае
_ _ _ _
Јх1 - х2Ј Јх1 - х2Јn1n2
t = ---------- = ----------------- . (I.4.9)
s 2 2
Р n2s1 + n1s2
Вычисленное по уравнению I.4.9 значение t сравнивают с
табличным значением t(Р, f), как это описано выше для случая 1.
2 2
Рассмотрение проблемы упрощается, когда n1 ~= n2 и s1 >> s2.
_
Тогда в отсутствие систематической ошибки среднее х2 выборки
объема n2 принимают за достаточно точную оценку величины А, т.е.
_ _
принимают х2 = "ми." Справедливость гипотезы х1 = "ми",
эквивалентной гипотезе I.4.3, проверяют с помощью выражений
I.3.1, I.3.2, принимая f1 = n1 - 1. Гипотеза I.4.3 отклоняется,
как статистически недостоверная, если выполняется неравенство
I.3.2.
3. Известно точное значение величины А. Если А = "ми",
_ _
проверяют две гипотезы: х1 = "ми" (I.4.6) и х2= "ми" (I.4.7).
Проверку выполняют так, как описано в разделе I.3 с
помощью выражений I.3.1 и I.3.2, отдельно для каждой из гипотез.
Если гипотезы I.4.6 и I.4.7 статистически достоверны, то следует
признать достоверной и гипотезу I.4.3. В противном случае
гипотеза I.4.3 должна быть отброшена.
Примечание I.4.2. В случае, предусмотренном примечанием I.1.2,
_ 2
при сравнении средних используют величины lg х , s и s .
g lg lg
_ _
Когда разность (x1 - х2) оказывается значимой, определяют
доверительный интервал для разности соответствующих генеральных
^ ^
средних (x1 и х2):
(I.4.10)
_ _ ^ ^ _ _
Јx1 - х2Ј - t(P,f)s <= Јx1 - х2Ј <= Јx1 - х2Ј + t(P,f)s
р р
Пример I.4.1. При определении содержания основного вещества в
двух образцах препарата, изготовленных по разной технологии,
получены метрологические характеристики средних результатов,
приведенные в табл. I.4.2. Требуется решить, является ли первый
образец по данному показателю лучшим в сравнении со вторым
образцом.
2
s2 0,31
Поскольку F = ---- = ---- = 1,24 < F (99%, 5,7) = 7,46, то
2 0,25
s1
согласно неравенству I.3.5а статистически достоверное различие
2 2
величин s1 и s2 отсутствует.
Таблица I.4.2
Љ”””””’””’”’”””””’””””’””””’””””’””’”””””’””””””’””””””’”””””””””Ї
ЈНомерЈ Ј Ј _ Ј 2 Ј Ј s_ ЈP Ј t Ј"ДЕЛЬ-Ј"ДЕЛЬ-Ј _______ Ј
Јобра-Јn ЈfЈ х Ј s Ј s Ј х Ј% Ј(P,f)ЈТА"х ЈТА"_ Ј"эпсилон"Ј
Јзца Ј Ј Ј % Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј х Ј % Ј
“”””””•””•”•”””””•””””•””””•””””•””•”””””•””””””•””””””•”””””””””¤
Ј 0 Ј1 Ј2Ј 3 Ј 4 Ј 5 Ј 6 Ј7 Ј 8 Ј 9 Ј 10 Ј 11 Ј
“”””””•””•”•”””””•””””•””””•””””•””•”””””•””””””•””””””•”””””””””¤
Ј 1 Ј8 Ј7Ј99,10Ј0,25Ј0,50Ј0,18Ј95Ј 2,36Ј 1,18 Ј 0,42 Ј 0,42 Ј
“”””””•””•”•”””””•””””•””””•””””•””•”””””•””””””•””””””•”””””””””¤
Ј 2 Ј6 Ј5Ј98,33Ј0,31Ј0,56Ј0,23Ј95Ј 2,57Ј 1,44 Ј 0,59 Ј 0,60 Ј
ђ”””””‘””‘”‘”””””‘””””‘””””‘””””‘””‘”””””‘””””””‘””””””‘”””””””””‰
_ _
Следовательно, гипотеза х1 = х2 (I.4.3) проверяется с помощью
уравнений I.1.7, I.1.8, I.4.4 и I.4.5.
k=g 2 2 2
SUM [(n - 1)s ] f1s1 + f2s2
k=1 k k
s = ----------------- = ----------- =
k=g f1 + f2
SUM (n - 1)
k=1 k
7 х 0,25 + 5 х 0,31
= ------------------- = 0,275;
7 + 5
----
/ 2 ------
s = / s = / 0,275 = 0,524.
2
2 s (n1+ n2) 0,275 х (8 + 6)
s = ------------- = ---------------- = 0,0802;
p n1n2 8 х 6
----
/ 2 -------
s = / s = / 0,0802 = 0,283.
р / р
f = n1 + n2 - 2 = 8 + 6 - 2 = 12.
_ _
Јх1 - х2Ј Ј99,10 - 98,33Ј
t = ---------- = --------------- = 2,72.
sр 0,283
t = 2,72 > t(95%; 12) = 2,18.
t = 2,72 < t(99%; 12) = 3,08.
Следовательно, с доверительной вероятностью Р = 95% гипотеза
_ _
х1 не равно х2 может быть принята. Однако с доверительной
вероятностью Р = 99% принять эту гипотезу нельзя из-за недостатка
информации.
_ _
Если гипотеза х1 не равно х2 принята, то определяют
^ ^
доверительный интервал разности генеральных средних х1 и х2
(уравнение I.4.10):
_ _ ^ ^ _ _
Јх1 - х2Ј - t(P, f)sр <= Јх1 - х2Ј <= Јх1 - х2Ј + t(P, f)sр
(Р = 95%; f = 12);
^ ^
Ј99,10 - 98,33Ј - 2,18 х 0,283 <= х1 - х2 <=
<= Ј99,10 - 98,33Ј + 2,18 х 0,283
^ ^
0,15 <= х1 - х2 <= 1,39
I.5. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
Оценка сходимости результатов параллельных определений. При
рядовых исследованиях аналитик обычно проводит два-три, реже
четыре параллельных определения. Варианты полученной при этом
упорядоченной выборки объема m, как правило, довольно значительно
отличаются друг от друга. Если метод анализа метрологически
аттестован, то максимальная разность результатов двух параллельных
определений должна удовлетворять неравенству:
Јх1 - х Ј < L(P, m)s, (I.5.1)
n
где L(P, m) - фактор, вычисленный по Пирсону при P = 95%.
Љ””””””’””””’””””””’”””””Ї
Ј m Ј 2 Ј 3 Ј 4 Ј
“””””””•””””•””””””•”””””¤
Ј L Ј2,77Ј 3,31 Ј 3,65Ј
ђ””””””‘””””‘””””””‘”””””‰
Если неравенство I.5.1 не выполняется, необходимо провести
дополнительное определение и снова проверить, удовлетворяет ли
величина Јх1 - х Ј неравенству I.5.1.
Ј nЈ
Если для результатов четырех параллельных определений
неравенство I.5.1 не выполняется, одна из вариант (х1 или х )
n
должна быть отброшена и заменена новой. При невозможности добиться
выполнения неравенства I.5.1 следует считать, что конкретные
условия анализа привели к снижению воспроизводимости метода и
принятая оценка величины s применительно к данному случаю является
заниженной. В этом случае поступают, как указано в разделе I.1.
Определение необходимого числа параллельных определений. Если
_
необходимо получить средний результат х с относительной
_______
погрешностью "эпсилон" <= "фи", причем метод анализа
метрологически аттестован, необходимое число параллельных
определений m находят, исходя из уравнения I.2.3:
Љ "ДЕЛЬТА"х 100 Ї2
m >= Ј -------------- Ј . (I.5.2)
Ј _ Ј
ђ "фи"х ‰
Гарантия качества продукции. Предположим, что качество
продукции регламентируется предельными значениями а и
min
а величины А, которую определяют на основании результатов
mах
анализа. Примем, что вероятность соответствия качества продукта
условию
а < А < а (I.5.3)
min mах
_
должна составлять Р%.
Пусть величину А находят экспериментально как среднее выборки
объема m, а метод ее определения метрологически аттестован. Тогда
_
условие I.5.3 будет выполняться с вероятностью Р, если значение
_
х = А будет лежать в пределах
_ _
а + "ДЕЛЬТА" А < А < а - "ДЕЛЬТА"А , (I.5.4)
min max
где: _
_ U(P)s
"ДЕЛЬТА"А = --------- . (I.5.5)
---
/ m
_ _
Значения коэффициента U для вероятности Р = 95% и Р = 99%
соответственно равны 1,65 и 2,33. Иными словами для гарантии
качества наблюдаемые пределы изменения величины А на практике
следует ограничить значениями:
_
_ U(P)s
А = а + "ДЕЛЬТА"А = а + -------- ; (I.5.6)
min min min ---
/ m
_
_ U(P)s
А = а - "ДЕЛЬТА"А = а - -------- ; (I.5.7)
max max max ---
/ m
Наоборот, если заданы значения А и А , значения а и
min max min
и а , входящие в неравенство I.5.3, могут быть найдены путем
max
решения уравнений I.5.6 и I.5.7. Наконец, если заданы пары
значений А , а и А , а , то уравнения I.5.6 и I.5.7
min min max max
могут быть решены относительно m. Это может быть использовано для
оценки необходимого числа параллельных определений величины А.
Примечание I.5.1. В уравнениях I.5.5, I.5.6 и I.5.7 величина
_ _
коэффициента U(P) должна быть заменена величиной t(P, f), если
значение f, определенное по уравнениям I.1.4 или I.1.8 < 15.
Примечание I.5.2. Для случая, предусмотренного примечанием
I.1.2, описанные в разделе I.5 вычисления проводят с
_
использованием величин lg х , lg х s и т.п.
g i lg
Пример I.5.1. Рассмотрим данные таблицы I.3.3, относящиеся к
выборке 1, как метрологическую характеристику используемого метода
анализа.
а) Пусть a = 98%, a = 100,50%. Тогда для испытуемого
min max _
образца продукта средний результат анализа А при проведении трех
параллельных определений (m = 3) должен находиться в пределах:
_ _
U(P)s U(P)s
а + --------- < А < а - --------
min --- max ---
/ m / m
_
При Р = 99%:
2,33 х 0,464 2,33 х 0,464
98 + ------------ < А < 100,5 - ------------;
--- ---
/ 3 / 3
98,62 < А < 99,88.
При Р = 95%:
1,65 х 0,464 1,65 х 0,464
98 + ------------ < А < 100,5 - ------------;
--- ---
/ 3 / 3
98,44 < А < 100,06.
б) Реальный средний результат анализа образца испытуемого
продукта А = 99% (при m = 3). Тогда определение пределов а и
min
а , гарантированно характеризующих качество данного образца с
max _
с заданной доверительной вероятностью Р, проводим, исходя из
уравнения I.5.6 или I.5.7, полагая
А = А = А.
min max
_
U(P)s
а = А - -------;
min ---
/ m
_
U(P)s
а = А + -------.
max ---
/ m
_
При Р = 99%:
2,33 х 0,464
а = 99 - ------------ = 98,38%;
min ---
/ 3
2,33 х 0,464
а = 99 + ------------ = 99,62%.
max ---
/ 3
_
При Р = 95%:
1,65 х 0,464
а = 99 - ------------ = 98,56%;
min ---
/ 3
1,65 х 0,464
а = 99 + ------------ = 99,44%.
max ---
/ 3
Полученные оценки а и а близки к границам
min max
_ "ДЕЛЬТА"х
доверительного интервала А +/- "ДЕЛЬТА"х = А +/- --------- =
---
/ m
0,97
= 99 +/- ----- = 99 +/- 0,56, что соответствует примечанию I.5.1.
---
/ 3
I.6. РАСЧЕТ И СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
ПАРАМЕТРОВ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ
При использовании ряда химических и физико - химических
методов количественного анализа непосредственному измерению
подвергается некоторая величина у, которая является линейной
функцией искомой концентрации (количества) х определяемого
вещества или элемента. Иными словами, в основе таких методов
анализа лежит существование линейной зависимости:
у = bх + а, (I.6.1)
где у - измеряемая величина; x - концентрация (количество)
определяемого вещества или элемента; b - угловой коэффициент
линейной зависимости; a - свободный член линейной зависимости.
Для использования зависимости I.6.1 в аналитических целях,
т.е. для определения конкретной величины x по измеренному значению
у, необходимо заранее найти числовые значения констант Ь и а, т.е.
провести калибровку. Иногда константы функции (I.6.1) имеют тот
или иной физический смысл, и их значения должны оцениваться с
учетом соответствующего доверительного интервала. Если калибровка
проведена и значения констант а и Ь определены, величину х находят
по измеренному значению у ; i
i
1 а
х = --- у - ---. (I.6.2)
i b i b
При калибровке величину х рассматривают как аргумент, а
величину у - как функцию. Наличие линейной зависимости между х и у
не всегда является очевидным. По этой причине экспериментальные
данные, полученные при калибровке, в первую очередь используют для
оценки жесткости, т. е. степени неслучайности линейной связи между
х и у, и лишь затем определяют значения констант а и b и их
доверительные интервалы. В первом приближении судить о жесткости
линейной связи между переменными х и у можно по величине
коэффициента корреляции r, который вычисляют по уравнению:
m m m (I.6.3)
m SUM х у - SUM х SUM у
1 i i 1 i 1 i
r = ----------------------------------------------------------
------------------------------------------------
/Љ Ї Љ Ї m
/ Ј m 2 m 2 Ј Ј m 2 m 2 Ј
/ Јm SUM х - (SUM х ) Ј Јm SUM у - (SUM у ) Ј
/ Ј 1 i 1 i Ј Ј 1 i 1 i Ј
/ ђ ‰ ђ ‰
исходя из экспериментальных данных, представленных в табл. I.6.1.
Чем ближе ЈrЈ к единице, тем менее случайна наблюдаемая линейная
зависимость между переменными х и у. В аналитической химии в
большинстве случаев используют линейные зависимости с
коэффициентом корреляции ЈrЈ >= 0,98 и только при анализе следовых
количеств рассматривают линейные зависимости с коэффициентом
корреляции ЈrЈ >= 0,9. Применение уравнения I.6.2 оправдано только
при ЈrЈ >= 0,95.
Коэффициенты a и b и другие метрологические характеристики
зависимости I.6.1 рассчитывают с использованием метода наименьших
квадратов по экспериментально измеренным значениям переменной у
для заданных значений аргумента х. Пусть в результате эксперимента
найдены представленные в табл. I.6.1 пары значений аргумента х и
функции у.
Таблица I.6.1
Љ”””””””’””””””””’””””””””Ї
Ј i Ј x Ј у Ј
Ј Ј i Ј i Ј
“”””””””•””””””””•””””””””¤
Ј 1 Ј х Ј у Ј
Ј Ј 1 Ј 1 Ј
“”””””””•””””””””•””””””””¤
Ј 2 Ј х Ј у Ј
Ј Ј 2 Ј 2 Ј
“”””””””•””””””””•””””””””¤
Ј ... Ј ... Ј ... Ј
“”””””””•””””””””•””””””””¤
Ј m Ј х Ј у Ј
Ј Ј m Ј m Ј
ђ”””””””‘””””””””‘””””””””‰
Тогда:
m m m
m SUM х у - SUM х SUM у
1 i i 1 i 1 i
b = ---------------------------- (I.6.4)
m 2 m 2
m SUM х - (SUM х )
1 i 1 i
m m
SUM у - b SUM х
1 i 1 i
а = --------------------- ; (I.6.5)
m
f = m - 2. (1.6.6)
Если полученные значения коэффициентов a и b использовать для
вычисления значений у по заданным в табл. I.6.1 значениям
аргумента х согласно зависимости I.6.1, то вычисленные значения Y
обозначают через Y1, Y2, ... Yi, ... Yn. Разброс значений у
i
2
относительно значений Yi, характеризует величина дисперсии s0 ,
которую вычисляют по уравнению:
m 2 m 2 m m
SUM (у - Yi) SUM у - аSUM у - bSUM х у
2 1 i 1 i 1 i 1 i i
s0 = -------------- = ------------------------------- . (I.6.7)
f f
В свою очередь дисперсии констант b и a находят по уравнениям:
2
2 ms0
s = --------------------; (I.6.8)
b m 2 m 2
mSUM х - (SUM х )
1 i 1 i
2
s
2 b m 2
s = ---- SUM х . (1.6.9)
а m 1 i
Стандартные отклонения s , и s и величины "ДЕЛЬТА"b и "ДЕЛЬТА"
b а
a, необходимые для оценки доверительных интервалов констант,
рассчитывают по уравнениям:
----
/ 2
s = / s ; (I.6.10)
b / b
----
/ 2
s = / s ; (I.6.11)
а / а
"ДЕЛЬТА"b = t(P; F)s ; (I.6.12)
b
"ДЕЛЬТА"а = t(P; F)s . (I.6.13)
а
Уравнению I.6.1 с константами a и b обязательно удовлетворяет
_ _
точка с координатами х и у, называемая центром калибровочного
графика:
m
SUM х
_ 1 i
х = --------; (I.6.14)
m
m
SUM у
_ 1 i
у = -------. (I.6.15)
m
Наименьшие отклонения значений у от значений Yi наблюдаются
i
в окрестностях центра графика. Стандартные отклонения s и s
у x
величины у и х, рассчитанных соответственно по уравнениям I.6.1 и
I.6.2 исходя из известных значений х и у, определяются с учетом
удаления последних от координат центра графика:
--------------------------------
/ _ 2
/ 2Љ 1 m(x - x) Ї
s = / s Ј--- + ----------------------Ј ; (I.6.16)
y / 0ђ m m 2 m 2 ‰
/ mSUM х - (SUM х )
/ 1 i 1 i
------------------------------------------
/ Љ _ _ 2 Ї
/ Ј m(у - у) Ј
/ 2 Ј 1 1 j Ј
s = / s0 Ј--- + --- + ---------------------------Ј(I.6.17)
x / --- Ј n m 2Љ m 2 m 2 Ї Ј
/ 2 Ј j b Ј mSUM х - (SUM х ) Ј Ј
/ b ђ ђ 1 i 1 i ‰ ‰
_
где у - среднее значение; n - число вариант, использованных
j _ j
при определении у .
j
_ _ _
При х = х и у = у:
j -----
/ 2
/ s0
s = / ----- ;
у / m
(I.6.16а)
----------------
/ 2 Љ Ї
/ sa Ј 1 1 Ј
s = / --- Ј--- + --- Ј.
x / 2 Ј n m Ј
/ b Ј j Ј
/ ђ ‰
С учетом значений s и s могут быть найдены значения величин
у x
"ДЕЛЬТА"у и "ДЕЛЬТА"x .
"ДЕЛЬТА"у = s t(P; F); (I.6.18)
у
"ДЕЛЬТА"x = s t(P; F). (I.6.19)
x
Значения s и "ДЕЛЬТА"x, найденные при n = 1, являются
x j
характеристиками воспроизводимости аналитического метода, если х -
концентрация, а у - функция х.
Обычно результаты статистической обработки по методу
наименьших квадратов сводят в таблицу (табл. I.6.2).
Таблица I.6.2
Результаты статистической обработки экспериментальных
данных, полученных при изучении линейной зависимости
вида y = bх + а
Љ”’”’”’”’”’”””””””’””””””’””””””’””’””’”””””””’””””””’””””””””””””Ї
ЈfЈ_Ј_ЈbЈаЈt(P, f)Ј"ДЕЛЬ-Ј"ДЕЛЬ-Ј 2Јr Ј s Ј"ДЕЛЬ-Ј"ДЕЛЬТАх"100Ј
Ј ЈxЈуЈ Ј Ј при ЈТА"b ЈТА"a Јs0Ј Ј x ЈТА"x Ј------------Ј
Ј Ј Ј Ј Ј ЈР = 95%Ј Ј Ј Ј Јпри Ј Ј _ Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Јn = 1,Ј Ј x Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј j _ Ј Ј Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ју = у Ј Ј Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј Ј j Ј Ј Ј
“”•”•”•”•”•”””””””•””””””•””””””•””•””•”””””””•””””””•””””””””””””¤
Ј1Ј2Ј3Ј4Ј5Ј 6 Ј 7 Ј 8 Ј 9Ј10Ј 11 Ј 12 Ј 13 Ј
ђ”‘”‘”‘”‘”‘”””””””‘””””””‘””””””‘””‘””‘”””””””‘””””””‘””””””””””””‰
Примечание I.6.1. Если целью экспериментальной работы являлось
определение констант b и a, графы 11, 12 и 13 табл. I.6.2 не
заполняются.
Примечание I.6.2. Если у = Ьlg x + a, вычисления, описанные в
разделе I.6, выполняют с учетом примечаний I.1.2 и I.2.2.
2
Примечание I.6.3. Сравнение дисперсий s0, полученных в разных
условиях для двух линейных зависимостей, может быть проведено, как
указано в разделе I.3 (см. выражения I.3.4, I.3.5 и I.3.5а).
II. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПРЕПАРАТОВ БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
II.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА
БИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Во многих случаях установление свойств препаратов при помощи
физических и химических анализов достаточно для полной
характеристики свойств этих препаратов, включая и их биологическую
активность. Однако физические и химические свойства препарата не
всегда могут быть стандартизованы. Нередки случаи, когда связь
между этими свойствами препарата и его биологической активностью
установлена недостаточно определенно и однозначно. В подобных
случаях биологическая активность фармакологического агента может
быть определена только при помощи непосредственного биологического
исследования.
Чаще всего показатель, характеризующий биологическую
активность препарата, учитывается в количественной форме:
например, масса аскорбиновой кислоты на 100 г ткани надпочечника
при действии кортикотропина, время свертывания крови при действии
гепарина и т. д. В этом случае конечным результатом испытания
следует считать среднее значение показателя у, а точнее -
доверительный интервал для у. О вычислении этих величин см.
разд. I.1 и I.2.
Пример II.1. При введении 7 мышам внутрибрюшинно раствора
гексенала в дозе 100 мг/кг получены следующие величины
продолжительности наркоза у (в минутах): 35; 83; 53; 60; 71; 62;
39. i
Расчет проводят по уравнениям: I.1.2; I.1; I.2.2 при Р = 95%.
_ 2
у = 57,60 мин; s = 287,64; s = 16,96; s_ = 6,41.
у
_
f = 6; t(95%, 6) = 2,45; "ДЕЛЬТА"у = 15,70.
_ _
у +/- "ДЕЛЬТА"у = 57,6 +/- 15,7;
у = 41,9 мин; у = 73,3 мин.
min max
Одной из важнейших задач биологических испытаний
фармакологических веществ является сравнение испытуемого препарата
со стандартным, для чего испытанию подвергаются одновременно две
или большее число (если испытания производятся при некотором
наборе доз) групп животных или других тест - объектов. При
составлении этих групп следует обеспечивать однородность тест -
объектов (в отношении пола, возраста, массы тела, условий
содержания и т. д.) внутри групп, а также распределение тест -
объектов по группам при помощи методов рандомизации.
Кроме того, следует стремиться к тому, чтобы число
тест - объектов во всех группах было одинаково. Это является
условием применимости ряда процедур статистического анализа,
описываемых ниже, и всегда упрощает вычисление во всех остальных
случаях.
Если по какой-либо причине (ошибка в эксперименте, гибель
животного, не связанная с испытанием) в некоторых из групп выпало
по одному результату, можно выровнять численности групп одним из
двух способов:
а) исключить из больших групп по одному результату, но
обязательно с применением рандомизации;
б) прибавить к каждой из меньших групп один результат, равный
среднему из оставшихся в этой группе результатов, но в дальнейших
расчетах число степеней свободы, относящихся к данной группе,
должно считаться на единицу меньшим.
Выбор того или другого способа выравнивания численностей в
группах зависит главным образом от числа групп, в которых
образовались пробелы.
В принципе эти процедуры можно применять и при различии в
численностях групп на две-три и большее число единиц, но это
всегда менее желательно, так как снижает точность и надежность
окончательных выводов по результатам испытания.
Сравнение стандартного и испытуемого препаратов, т.е. проверка
того, одинаковы ли их биологические активности, производится при
помощи критерия Стьюдента (см. раздел I.4).
Пример II.2. Опыт, описанный в примере II.1, был повторен на
другой группе из 7 мышей, но за 15 мин до введения гексенала
вводили (также внутрибрюшинно) акрихин в дозе 150 мг/кг.
Длительность наркоза у оказалась (в минутах): 75; 78; 114; 110;
i
93; 100; 87. Требуется выяснить, влияет ли предварительное
введение акрихина на действие гексенала.
_
Расчет по уравнениям I.1.2 - I.1.6 дает: у = 93,9 мин;
1
2
s = 226,48; s1 = 15,05; f1 = 6.
1
Далее с использованием уравнений I.1.8; I.1.4, I.4.1 и I.4.2
получают fобщ = 12, t = 4,24.
По табл. II приложения находим t (95%; 12) = 2,18. Сравнивая с
этим табличным значением полученное выше фактическое значение t =
4,24, можно заключить, что вероятность того, что акрихин влияет на
действие гексенала, превышает 95%. Используя более полную таблицу
критических значений t, имеющуюся во всех руководствах по
биометрии и математической статистике, можно убедиться, что данная
вероятность превышает даже 99%, так как t (99%; 12) = 3,05,
но эта вероятность несколько меньше 99,9%, ибо t (99,9%, 12) =
4,32.
При сравнении целенаправленных биологических активностей
вероятность различия 95% может считаться приемлемой. Но если,
например, решается вопрос об отсутствии вредных побочных действий,
то требования к вероятности значительно возрастают. При подозрении
особо опасного побочного действия "степень риска" (100 - Р) =
"альфа" (эту величину называют уровнем значимости) следует снижать
-4
до значений 10 или даже меньших; соответствующие критические
значения t(P, f) можно найти в специальных
математико - статистических таблицах. Если выбран определенный
уровень значимости "альфа", то при t > t(P) различие считается
значимым. В этом случае по уравнению I.4.6 вычисляют доверительный
интервал разности сравниваемых показателей.
Чувствительность указанного метода сравнения двух препаратов
значительно возрастает, если можно организовать испытание их на
ряде достаточно однородных (сопряженных) пар тест - объектов.
Сопряженную пару могут составить, например, животные из одного
помета, одинакового пола и близкой массы тела или, если это
допускается методикой испытания, два повторных определения на
одном животном с достаточным разрывом во времени, обеспечивающим
восстановление исходного состояния после первого опыта.
В первом случае каждая из групп должна состоять наполовину из
"более тяжелых" членов пар и наполовину из "более легких". Во
втором случае в один день половина группы подвергается одному
воздействию и другая половина - другому, а в другой день подгруппы
меняются местами; это делается, чтобы исключить возможный
дополнительный источник различий.
При использовании n сопряженных пар составляется ряд разностей
______
"ДЕЛЬТА"
"ДЕЛЬТА" = у2 - у1 и вычисляется величина t = -------- , где
s ______
"ДЕЛЬТА"
______
"ДЕЛЬТА" = SUM "ДЕЛЬТА" / n,
---------------------------
/ ______ 2
/ SUM ("ДЕЛЬТА" - "ДЕЛЬТА")
/ n
s = / ----------------------.
2 / n(n - 1)
"ДЕЛЬТА"
Полученная величина t (без учета знака) сравнивается с табличным
значением t (P,f) для принятого уровня значимости "альфа" и числа
степеней свободы f = n - 1.
Пример II.3. Пусть тест - объекты N 1, 2, ... 7 из примера
II.1 были сопряжены с тест - объектами N 3, 1, 5, 2, 6, 4, 7 из
примера II.2 (в каждой паре были мыши из одного помета примерно с
______
одинаковой массой тела). Тогда получается: "ДЕЛЬТА" = 254/7 =
36,3, S = 3,65, t=9,94, в то время как t (95%,7) = 2,36 и
______
"дельта"
t(99%, 7) = 3,50; t (99,9%, 7) = 5,4 (последнее значение взято из
более полной таблицы значений t (P,f). Значит, при учете
сопряженности пар (т.е. при исключении вариаций между пометами)
различие констатируется с большей вероятностью (Р > 99,9%), чем
без учета этой сопряженности.
II.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЗОВОЙ ЗАВИСИМОСТИ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Биологическая активность препарата зависит от примененной
дозы, и выяснение характера этой зависимости - одна из важных
задач испытания препарата.
Многочисленные наблюдения показывают, что в интервале обычно
применяемых доз фармакологический эффект (когда он выражается
количественно) в первом приближении связан линейно с логарифмом
дозы lg D.
у = у0 + blg D, (II.2.1)
где y0 и b - некоторые константы. Задачей испытания является
проверка линейности связи между y и lg D, а затем
негоризонтальности линии связи, т. е. наличия зависимости эффекта
от дозы. Лишь после этого можно перейти к оценке констант у0 и b.
Для проверки линейности связи требуется измерить активности
у1, у2, у3 по крайней мере для трех разных доз D1, D2, D3. Расчет
существенно упрощается, если численности групп тест - объектов n,
на которых исследуется действие доз D1, D2, D3, одинаковы, а сами
дозы выбраны так, что lg D3 - lg D2 = lg D2 - lg D1, т. е. D3/D2 =
D2/D1 . Иными словами D 2 должно быть средним геометрическим из D1
.
и D3, так что lg D2 находится посередине интервала lg D1 - lg D3.
.
В этом случае критерием линейности может служить отношение:
_ _ _
у1 + у3 - 2у2
t = ------------------------- , (II.2.2)
-------------------
/ 2
/ 2 SUM d / n(n - 1),
/ n
2 _ 2 _ 2 _ 2
где SUM d = SUM (у1 - у1) + SUM (у2 - у2) + SUM (у3 - у3) .
n n n n
Когда численности групп неодинаковы, для n = n1 + n2+ n3
производится замена:
2 2
SUM d SUM d
n n 1 1 1
---------- -> ----------------- (--- + --- + ---). (II.2.3)
n(n - 1) n1 + n2 + n3 - 3 n1 n2 n3
Если значение t, вычисленное по II.2.2, окажется больше
критического значения t (P, f) для числа степеней свободы <*> f =
3 x (n - 1), то гипотезу о линейности связи между у и lg D можно
отвергнуть с вероятностью, большей Р.
--------------------------------
<*> f = n1 + n2 + n3 - 3 при неравных численностях групп.
Если гипотеза о линейности связи не опровергается, то
переходят к проверке значимости наклона прямой, выражающей
зависимость эффекта от дозы. Для этого вычисляют величину:
-------------
/ 3n(n - 1) _ _
t = / ----------- (у3 - у1). (II.2.4)
/ 2
/ 2 SUM d
/ n
Если эта величина окажется меньше, чем t(95%, f) при f =
3(n - 1), то можно считать, что эффект не зависит от дозы; если же
t > t(95%, f), то эффект зависит от дозы <*>.
--------------------------------
<*> Может показаться, что если эффект не зависит от дозы, то
теряет смысл проверка линейности связи между у и lg D, и анализ
надо начинать с применения критерия II.2.4, а не II.2.2. Но это не
так. Если зависимость нелинейна, то критерий II.2.4 относится к
среднему наклону, который может оказаться равным нулю, хотя
активность при разных дозах различна.
Когда линейный характер зависимости у от lg D известен для
препарата данного состава из предыдущих исследований и требуется
лишь проверить значимость наклона прямой, выражающей эту
зависимость, то можно обойтись испытаниями только для двух доз D1
и D2. В этом случае вместо II.2.4 для вычисления t применяют
формулу:
-----------
/ n(n - 1) _ _
t = / ---------- (у2 - у1). (II.2.5)
/ 2
/ SUM d
/ n
Љ 2 _ 2 _ 2Ї
Јf = 2(n - 1), причем SUM d = SUM (у1 - у1) + SUM (у2 - у2) Ј.
ђ n n n ‰
При различных численностях групп в II.2.5 производят замену,
аналогичную II.2.3.
Если по критерию II.2.4 или II.2.5 установлено, что эффект
зависит от дозы, то оценку констант Ь и у0 проводят по формулам:
_ _
у3 - у1
b = -------------; (II.2.6)
lg D3 - lg D1
_ _ _
у0 = (у1 + у2 + у3) / 3 - b(lg D1 + lg D3) / 2 (II.2.7)
при использовании трех доз и
_ _
у2 - у1
b = -------------; (II.2.8)
lg D2 - lg D1
Љ _ _ Ї
y0 = Ј(у1 + у2) - b(lg D1 + lg D2)Ј / 2 (II.2.9)
ђ ‰
при использовании двух доз. Доверительные интервалы для этих
параметров строятся с использованием их стандартных ошибок, равных
при трех дозах:
------------------- ----------
/ 2 / 2
/2 SUM d / n(n - 1) / SUM d
/ n / n
s = ------------------------ ; s = / --------------- ,
b lg D3 - lg D1 у0 / 2n(n - 1)
(II.2.10)
а при двух дозах
------------------- -----------
/ 2 / 2
/2 SUM d / n(n - 1) / SUM d
/ n / n
s = ------------------------ ; s = / --------------- ,
b lg D2 - lg D1 у0 / 2n(n - 1)
(II.2.11)
Оценки параметров Ь и у0 получаются более точными, если
испытания проведены при большем числе доз. В этом случае
вычисления должны производиться по общим формулам регрессионного
анализа. В частности (см. раздел I.6),
SUM (xу) - SUM x SUM у/n
n n n
b = ------------------------, (II.2.12)
2 2
SUM x - (SUM x) / n
n n
у0 = (SUM у - bSUM x) / n, (II.2.13)
n n
где x = lg D, a n - общее число экспериментальных точек для всех
доз. Достаточно хорошее приближение получается, если в эти формулы
_
вместо индивидуальных значений у подставить значения у для каждой
из доз; в этом случае n будет означать число доз, а значения х и
2
х будут входить в соответствующие суммы по одному разу.
II.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭКВИВАЛЕНТНЫХ ДОЗ
Одной из основных задач биологического испытания является
0
установление эквивалентной дозы, т.е. той дозы D стандартного
препарата, которой соответствует по своей биологической активности
доза D испытуемого препарата.
Биологическая активность последнего может очень сильно
зависеть от особенностей выбранной группы тест - объектов, их
физиологического состояния, времени года, деталей лабораторной
методики и многих других факторов. Поэтому определение
эквивалентных доз требует одновременного применения испытуемого и
стандартного препаратов к двум подгруппам однородной группы
тест - объектов.
Определение эквивалентных доз требует также знания того, как
биологическая активность зависит от дозы. Описанные ниже методы
относятся к тому наиболее частому случаю, когда биологическая
активность у связана линейно с логарифмом дозы D по уравнению
II.2.1; проверка такой линейности производится при помощи критерия
II.2.2.
Испытуемый препарат может отличаться от стандартного как по
наклону прямой (т.е. по значению коэффициента Ь), так и по ее
положению (т.е. по значению постоянной у0).
Если имеются основания предполагать, что наклоны обеих прямых
одинаковы (Ь = Ь0) и, следовательно, различие между препаратами
обусловлено лишь различными значениями параметра у0, то для
установления эквивалентных доз достаточно определить активность
одного из препаратов при двух различных дозах, а другого - при
одной дозе. Разумеется, активность для каждой дозы должна
определяться из нескольких измерений, так что речь идет здесь о
средних активностях. Во всех случаях предполагается, что для
каждой дозы использовано одно и то же число n тест - объектов и
что все распределения случайных вариаций нормальны с дисперсией,
не зависящей от самих активностей.
Если нет достаточных оснований предполагать, что Ь = Ь0, то
следует произвести для каждого препарата испытания по крайней мере
0 0
при двух дозах: D1, D2 и D1, D2; удобнее выбрать эти дозы так,
0 0
чтобы D2 / D1 = D2 / D1. Вообще же результаты испытания получаются
тем точнее, чем больше доз использовано. Поэтому, помимо
упомянутых выше испытаний, т. е. испытаний типов 1; 2 (или 2; 1) и
2; 2, в фармакопее предусматриваются также испытания других типов
(см. табл. IV, приложения).
По результатам испытаний вычисляют прежде всего средние
эффекты при каждой из доз - отдельно для стандартного и
испытуемого препаратов. Затем находят значения.
_
"ФИ" = SUM "е "у / "z ", (II.3.1)
ФИ ФИ
где "ФИ" - общее обозначение для функций Е, F, G, Н (см. табл. IV,
_
приложения), а через у обозначена вся совокупность средних
_0 _0 _0 _0 _ _ _
значений у1, у2, у3, у4, у1, у2, у3, у4; множители "е ", и
ФИ
знаменатели "z " берутся из табл. IV приложения. Полученные
ФИ
величины характеризуют: Е - различие между эффектами вследствие
различия доз; F - различие между эффектами вследствие различия
между препаратами; G - параллельность дозовых зависимостей
испытуемого и стандартного препарата; Н - линейность этих дозовых
зависимостей. Для испытаний типов 2; 1,3; 1, 3; 2 и 4; 3 надо
0 _
переставить местами коэффициенты "е " для у и у, причем для F и
ФИ
G с изменением всех знаков на обратные, а для Е и Н - без
изменения знаков; значения "z " и дисперсий остаются без
ФИ _0
изменения. Значения Н должны вычисляться отдельно для набора у и
_
отдельно для набора у, т.е. линейность дозовой зависимости
проверяется отдельно для стандартного и отдельно для испытуемого
препаратов.
По результатам испытания вычисляется также величина:
Љ n _ 2 Ї
SUM Ј SUM (у - у ) Ј
i ђ j=1 ij i ‰
V = ----------------------- , (II.3.2)
0
(r + r)n(n - 1)
_
где у - индивидуальные эффекты при i-й дозе, у , - средний
ij 0 i
эффект при этой дозе; r , r - соответственно число доз для
стандартного и испытуемого препаратов; n - число испытаний при
каждой дозе (оно должно быть одинаковым при всех дозах; нарушения
этого исправляются так, как было описано в параграфе II.1). После
этого по формулам в последнем столбце табл. IV приложения
вычисляют величины А, В, V и V , необходимые для построения
G H
доверительных интервалов и проверки значимостей [при этом
используется табличное значение t для числа степеней свободы f =
0 Р
(r + r)(n - 1); I - разность логарифмов соседних доз].
Прежде всего проверяют (где это допускается числом
использованных доз) линейность дозовых зависимостей и их
параллельность, вычисляя
H
t = --------- ; (II.3.3)
----
/ V
/ H
G
t = --------- . (II.3.4)
----
/ V
/ G
Полученные значения должны быть меньше t(95%, Р).
Если нарушения линейности и параллельности дозовых
зависимостей не обнаружено, то вычисляют:
b = E / I (II.3.5)
- наклон прямой дозовой зависимости (средний для обоих
препаратов);
M = F / b (II.3.6)
- логарифм отношения эквивалентных доз, т. е. величину
0
М = lg (D / D);
0
D / D = antilg (2 + M) (II.3.7)
- отношение эквивалентных доз (в процентах);
t ---------------
M P / 2
M = ----- +/- ---------- / A(1 - g) + BM (II.3.8)
H;B 1 - g b(1 - g) /
- Р-процентные доверительные границы для М, причем
2 2
g = Bt / b ; (II.3.9)
P
наконец, получают
0
(D / D) (II.3.10)
H; B
- Р-процентные доверительные границы для отношения эквивалентных
доз (в процентах).
Середины доверительных интервалов II.3.8 не совпадают со
значениями М из II.3.6, особенно при больших значениях g. Величина
g должна быть всегда меньше единицы, в противном случае весь опыт
следует считать некорректным и нуждающимся в повторении.
Если можно предположить, что активности испытуемого и
стандартного препаратов отличаются незначительно, следует выбирать
1 0 0
дозы так, чтобы было соответственно lg D = --- (lg D1 + lg D2),
2
0 1
lg D = --- (lg D1 + lg D2) в испытаниях типа 2; 1 и 1; 2 либо
2
0 0
D1 = D1; D2 = D2 в испытании типа 2; 2 и т. д. При существенном
отличии этих активностей такой выбор доз неоптимален и от него
следует отказаться. В этом случае из значения М, полученного по
1 0 0
формуле II.3.6, следует вычесть величины lg D - - (lg D1 + lg D2),
2
0 1 0
lg D - --- (lg D1 + lg D2), lg D1 - lg D1 или др. в зависимости
2
от типа испытания. В формулы II.3.7 и II.3.8 должно войти уже
скорректированное значение М.
Пример II.4. В табл. II.3.1 приведены результаты испытания по
стандартизации образца АКТГ; эффект характеризуется концентрацией
(в мг%) аскорбиновой кислоты в надпочечнике. В данном случае мы
имеем испытание типа 2; 3. По формуле II.3.1 получаем, используя
_
значения "e " и "z " из табл. IV приложения, а значения у - из
ФИ ФИ
табл. II.3.1:
_0 0 _ _ _
Е = [(-1)у1 + 1у2 + (-2)у1 + 0у2 + 2у3] / 5 =
= (-351 + 269 - 2 х 336 + 2 х 189) / 5 = -75,2;
F = (- 3 х 351 - 3 х 269 + 2 х 336 +
+ 2 х 256 + 2 х 189) / 6 = - 49,67;
G = (2 х 351 - 2 х 269 - 336 + 189) / 2 = 8,5:
Н = 336 - 2 х 256 + 189 = 13,0.
Далее по данным из табл. II.3.1 находим:
2552 + 1660 + 1958 + 2802 + 1582
V = --------------------------------- = 70,36,
(2 + 3) х 6 x (6 - 1)
так что формулы последнего столбца табл. IV, приложения, дают
значения:
А = 5 х 70,36/6 = 58,63; B = 77,66; V = 175,90; V = 422,16.
G H
При вычислении B учтено, что I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602.
Проверка на линейность дозовой зависимости и на параллельность
прямых дает:
--- -------
H / /V = 13,0 / / 422,16 = 0,633;
/ Н
--- -------
G / /V = 8,5 / / 175,90 = 0,641.
/ G
Таблица II.3.1
Уровни факторов (дозы)
Љ””””””””””””””””’”””””””””””’”””””””””””’”””””””””””’”””””””””””’”””””””””””Ї
Ј Ј 0 Ј 0 Ј Ј Ј Ј
Ј Эффекты Ј 0 y1, Ј 0 y2, Ј y1, Ј y2, Ј y3, Ј
Ј ЈD1 = 0,1 ЕДЈD2 = 0,4 ЕДЈD1 = 0,1 ЕДЈD2 = 0,4 ЕДЈD3 = 1,6 ЕДЈ
“””””””””””””””””•”””””””””””•”””””””””””•”””””””””””•”””””””””””•”””””””””””¤
Ј Ј 370 Ј 225 Ј 310 Ј 276 Ј 187 Ј
Ј Ј 342 Ј 268 Ј 356 Ј 228 Ј 215 Ј
Ј Ј 335 Ј 284 Ј 345 Ј 252 Ј 200 Ј
Ј y Ј 369 Ј 247 Ј 313 Ј 273 Ј 168 Ј
Ј ji Ј 318 Ј 296 Ј 340 Ј 279 Ј 193 Ј
Ј _ Ј 372 Ј 264 Ј 352 Ј 228 Ј 171 Ј
Ј y Ј 351 Ј 269 Ј 336 Ј 256 Ј 189 Ј
Ј i Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј n _ 2Ј Ј Ј Ј Ј Ј
Ј SUM (y - y) Ј 2552 Ј 1660 Ј 1958 Ј 2802 Ј 1582 Ј
Ј j=1 ij Ј Ј Ј Ј Ј Ј
ђ””””””””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‘”””””””””””‰
0
Обе эти величины меньше, чем t(95%; f) = 2,060 [для f = (r + r) х
(n - 1) = 25 степеней свободы], так что можно продолжать расчет.
По формулам II.3.5 и II.3.6 получаем:
Ь = - 75,2 / 0,602 = -124,9;
M = - 49,67 / (-124,9) = 0,3977.
Поскольку в данном испытании средние дозы стандартного и
испытуемого препаратов не совпадают, то надо из M вычесть
величину
lg 0,l + lg 0,4 + lg l,6 lg 0,1 + lg 0,4
------------------------ - --------------- =
3 2
= - 0,3980 + 0,6990 = 0,3010,
так что
0
М = 0,3977 - 0,3010 = 0,0967; D /D = 124,9%.
Далее вычисляем по формулам II.3.9 и II.3.8:
2
77,66 х 1,960
g = ------------- = 0,0191; 1 - g = 0,9809;
2
(- 124,9)
0,0967 1,96
M = ------- +/- ------------------ x
H,B 0,9809 (- 124,9) х 0,9809
--------------------------------
x / 58,63 х 0,9809 + 77,66 х 0,0961 = [- 0,0235; 0,2207].
Окончательно получаем:
0
(D /D) = [94,7%; 166,2%].
H, B
Доверительные интервалы во всех этих испытаниях могут быть
сужены, если использовать в опыте сопряженные группы животных.
Например, в испытании типа 2;2 целесообразно использовать n
четверок животных, каждая из которых содержит животных из одного
помета, одинакового пола и близкой массы тела; каждая четверка
0 0
животных используется для определения четверки значений: у1; у2,
у1 и у2. При такой постановке опыта
2 2
SUM d - SUM "ДЕЛЬТА"
V = ---------------------, (II.3.11)
3n(n - 1)
2
где d - числитель формулы II.3.2, а
2 0 0 _0 _0 _ _ 2
SUM "ДЕЛЬТА" = SUM [(у1 + у2 + у1 + у2) - (у1 + у2 + у1 + у2)] .
(II.3.12)
Число степеней свободы равно f = 3(n - 1).
Доверительный интервал может быть также сужен, если методика
испытания допускает выполнение повторных определений на каждом
животном - с достаточным разрывом во времени, обеспечивающем
восстановление исходного состояния после первого опыта. В
повторном опыте те животные, на которых определялась активность
0
у , используются для определения у и наоборот. Кроме того,
животные, получившие в первом опыте меньшую дозу, получают во
втором опыте большую дозу и наоборот (метод двойного перекреста,
см. табл. II.3.2).
Таблица II.3.2
Љ””””””””’””””””””””””’””””””””””””’”””””””””””””””””””””””””””””Ї
Ј Группа Ј Первый Ј Второй Ј Разность результатов Ј
ЈживотныхЈ опыт Ј опыт Ј Ј
“””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј Ј 0 Ј Ј 0 Ј
Ј1 Ј у1 Ј у2 Ј ДЕЛЬТА1 = у2 - у1 Ј
“””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј Ј 0 Ј Ј 0 Ј
Ј2 Ј у2 Ј у1 Ј ДЕЛЬТА2 = у1 - у2 Ј
“””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј Ј Ј 0 Ј 0 Ј
Ј3 Ј у1 Ј у2 Ј ДЕЛЬТА3 = у2 - у1 Ј
“””””””””•””””””””””””•””””””””””””•”””””””””””””””””””””””””””””¤
Ј Ј Ј 0 Ј 0 Ј
Ј4 Ј у2 Ј у1 Ј ДЕЛЬТА4 = у1 - у2 Ј
ђ””””””””‘””””””””””””‘””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””””‰
При таком построении испытания надо пользоваться формулами:
______ ______ ______ ______
E = (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА2 + ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.13)
______ ______ ______ ______
F = (ДЕЛЬТА1 + ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА4) / 4; (II.3.14)
______ 2 ______ 2
SUM (ДЕЛЬТА1 - ДЕЛЬТА1) + SUM (ДЕЛЬТА2 - ДЕЛЬТА2)
n n
V = ------------------------------------------------------ +
8n(n - 1)
(II.3.15)
______ 2 ______ 2
SUM (ДЕЛЬТА3 - ДЕЛЬТА3) + SUM (ДЕЛЬТА4 - ДЕЛЬТА4)
n n
+ -----------------------------------------------------;
8n(n - 1)
2
А = V/2, B = V/(2I ). (II.3.16)
Дальнейшие расчеты производят по формулам II.3.5 - II.3.10,
причем t(P, f) берется из табл. II приложения для числа степеней
свободы f = 4 (n - 1).
Пример II.5. В табл. II.3.3. приведены результаты испытания
(стандартизация образца АКТГ), построенного по методу двойного
перекреста (в примере II.4 эти же данные были использованы в
умышленно рандомизированном виде, чтобы не сказывался эффект
сопряженности тест - объектов). По формулам II.3.13 - II.3.16
(получаем):
Е = (-90 - 66 - 68 - 101)/4 = -81,25;
F = (-90 + 66 + 68 - 101)/4 = -14,25;
V = (1178 + 104 + 258 + 546)/(8 х 3 х 2) = 43,46;
2
А = 43,46/2 = 21,73; В = 43,46/(2 х 0,602 ) = 59,96
(I = lg 0,4 - lg 0,1 = 0,602);
кроме того, f = 4 х 2 = 8, t (95%, 8) = 2,306.
Теперь по формулам II.3.5-II.3.10 находим:
Ь = -81,25/0,602 = -135,0;
0
M = -14,25 / (-135,0) = 0,1056; D /D = 127,6%;
2 2
g = 59,96 х 2,306 / (-135,0) = 0,0175; 1 - g = 0,9825;
0,1056
М = ------ +/-
H,B 0,9825
--------------------------------
2,306 / 2
+/- ---------------- / 21,73 х 0,9825 + 59,96 х 0,1056 =
- 135,0 х 0,9825
= 0,1075 +/- 0,0816 = [0,0259; 0,01891];
0
(D /D) = [106,1%; 154,6%].
H,B
0
Доверительный интервал для D /D получился более узким, чем без
учета сопряженности тест - объектов (см. пример II.4), хотя
использовано меньше результатов испытаний.
Когда имеются результаты нескольких независимых определений
эквивалентных доз, их можно объединить с целью получения более
0
точной оценки для D /D и более узкого доверительного интервала для
этой величины. При этом пользуются приближенными формулами (точные
формулы весьма громоздки):
_
_ M
M = ------ +/- t(P, f)S , (II.3.17)
H,B 1 - g M
_
M Mj
------ = SUM (Wj -----) / SUM Wj ; (II.3.18)
1 - g 1 - g
j
-------
S = 1 / / SUM Wj , (II.3.19)
M
2
где весовыми коэффициентами Wj, служат обратные дисперсии 1 / s :
Mj
2 2
b (1 - g )
1 j j
Wj = ---- = -------------------; (II.3.20)
2 2
s Аj(1 - g ) + BjMj
Mj j
j = 1, 2, ..., k есть номер испытания, a t(P, f) берется для числа
степеней свободы, равного сумме чисел степеней свободы отдельных
испытаний: f = SUM f . Доверительный интервал для усредненного
0 j
отношения D /D находят по формуле:
_
(D0/D) = antilg(2 + M ). (II.3.21)
H,B H,B
Законность указанного объединения (т. е. случайности различия
между отдельными М) проверяют при помощи критерия "хи - квадрат":
2 Љ Ї2
2 Mj Ј Mj Ј
"хи" = SUM (Wj --------- ) - ЈSUM (Wj ------)Ј / SUM Wj (II.3.22)
2 2 Ј 1 - g Ј
(1 - g ) ђ j ‰
j
2 2 2
должно быть "хи" < "хи" (95%, f), где "хи" (95%, f) берут из
табл. II
Таблица II.3.3
Љ””””””’”””””””””””””””’”””””””””””””””’””””””’”””””””””””””””’””””Ї
ЈГруппаЈ1-й день опыта Ј2-й день опыта Ј"ДЕЛЬ-Јd = "ДЕЛЬТА" - Ј 2 Ј
Ј Ј Ј ЈТА" Ј ______ Јd Ј
Ј Ј Ј Ј Ј- "ДЕЛЬТА" Ј Ј
“””””””•”””””””””””””””•”””””””””””””””•””””””•”””””””””””””””•””””¤
Ј1 Ј 370Ј 273Ј- 97 Ј- 7 Ј49 Ј
Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Јy1 342Јy2 279Ј- 63 Ј 27 Ј729 Ј
Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ј ЈD1 = 0,1 ЕД 335ЈD2 = 0,4 ЕД 225Ј- 110 Ј- 20 Ј400 Ј
Ј Ј ЈСумма Ј- 270 Ј 0 Ј1178Ј
Ј Ј ЈСреднее Ј- 90 Ј Ј Ј
Ј2 Ј 255Ј 313Ј 58 Ј- 8 Ј64 Ј
Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Јy2 268Јy1 340Ј 72 Ј 6 Ј36 Ј
Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ј ЈD2 = 0,4 ЕД 284ЈD = 0,1 ЕД 352Ј 68 Ј 2 Ј4 Ј
Ј Ј ЈСумма Ј 198 Ј 0 Ј104 Ј
Ј Ј ЈСреднее Ј 66 Ј Ј Ј
Ј3 Ј 310Ј 247Ј- 63 Ј 5 Ј25 Ј
Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј
Ј Јy1 356Јy2 296Ј- 60 Ј 8 Ј64 Ј
Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј
Ј ЈD1 = 0,1 ЕД 345ЈD2 = 0,4 ЕД 264Ј- 81 Ј- 13 Ј169 Ј
Ј Ј ЈСумма Ј 204 Ј 0 Ј258 Ј
Ј Ј ЈСреднее Ј- 68 Ј Ј Ј
Ј4 Ј 276Ј 369Ј 93 Ј- 8 Ј64 Ј
Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј
Ј Јy2 228Јy1 318Ј 90 Ј- 11 Ј121 Ј
Ј Ј Ј 0 Ј Ј Ј Ј
Ј ЈD2 = 0,4 ЕД 252ЈD1 = 0,1 ЕД 372Ј 120 Ј 19 Ј361 Ј
Ј Ј ЈСумма Ј 303 Ј 0 Ј546 Ј
Ј Ј ЈСреднее Ј 101 Ј Ј Ј
ђ””””””‘”””””””””””””””‘”””””””””””””””‘””””””‘”””””””””””””””‘””””‰
приложения для числа степеней свободы f = k - 1 (k - число
объединяемых испытаний). В частности, когда объединяются
результаты двух испытаний, то
Љ M1 M2 Ї
W1W2Ј------ - ------ Ј
2 ђ1 - g1 1 - g2 ‰
"хи" = ------------------------- (II.3.23)
W1 + W2
2
при f = 1, так, что "хи" (95%, 1) = 3,84.
II.4. ПРИМЕНЕНИЕ СХЕМЫ ЛАТИНСКОГО КВАДРАТА
При биологическом испытании антибиотиков методом диффузии в
агар на лотках наиболее употребительна схема латинского квадрата,
позволяющая рандомизировать неоднородность бактериальной культуры
по обоим направлениям поверхности питательной среды. Например, в
случае испытания 2; 2 дозы могут располагаться следующим образом:
0 0
D1 D2 D1 D2
0 0
D2 D1 D2 D1
(II.4.1)
0 0
D1 D2 D1 D2
0 0
D2 D1 D2 D1
Здесь каждая доза встречается по одному разу в каждой строке и
в каждом столбце. В данном случае последовательные строки получены
циклической перестановкой из предыдущих строк, но это не
единственный способ построения латинского квадрата. Например,
можно переставлять столбцы или строки (или и то, и другое) из
приведенной выше схемы по жребию. В руководствах по планированию
эксперимента можно найти и другие схемы.
Если для стандартного и испытуемого препаратов используются
по три дозы, то соответствующий латинский квадрат будет иметь
шесть строк и шесть столбцов и т.д. При двух дозах стандартного
и двух дозах испытуемого препарата можно построить латинский
квадрат 8х8, располагая дозы так, чтобы каждая встречалась по два
раза в каждой строке и в каждом столбце.
0
Введем следующие обозначения: k - число строк в квадрате; r и
r - соответственно число использованных доз стандартного и
0
испытуемого препаратов (например, при размещении четырех доз D1,
0 0
D2, D1, D2 в квадрате 8х8 будет k = 8, r = 2, r = 2, а для
0
квадрата II.4.1: k = 4, r = 2, r = 2); у - эффективность в
ij
ячейке квадрата на пересечении i-й строки и j-го столбца
(независимо от того, относится эта эффективность к стандартному
_ _
или испытуемому препарату); у = SUM у /k и у = SUM у / k -
i j ij j ij
средние эффективности соответственно для строки i и для столбца j;
2 _ _
у = SUM y /k = SUM у /k = SUM у / k
i,j i,j i i j j
- общая средняя эффективность для всего комплекса. Тогда
2 Љ 2 2Ї
SUM d - k ЈSUM d + SUM d Ј
j,i ђ i i j j‰
V = ----------------------------- , (II.4.2)
2 0
n(k - 2k - r - r + 2)
2 Љ _ 2Ї Љ _ 2Ї
где SUM d = SUM ЈSUM (у - у ) Ј = SUM ЈSUM (у - у ) Ј,
i ђ j i,j i ‰ j ђ i,j j ‰
2 _ _ 2 2 _ _ 2
SUM d = SUM (у - у ) , SUM d = SUM (у - у ) ,
i i i j j j
а n - число испытаний при каждой дозе стандартного или испытуемого
препарата. Остальные расчеты производятся по формулам предыдущего
параграфа, причем t(P, f) берутся из табл. II приложения для числа
степеней свободы f = (k -1)(k - 2).
Пример II.6. В табл. II.3.3 приведены результаты совместного
испытания стандартного и испытуемого препаратов неомицина при
дозах 100 и 200 мкг в 1 мл; активность характеризуется диаметром
зоны угнетения в миллиметрах. Использован латинский квадрат вида
(II.4.1). В этой же таблице показаны расчеты, приводящие к
2 2
величинам SUM d и SUM d , а в табл. II.4.2 показано вычисление
i i j j 2
средних дозовых эффективностей и величины SUM d .
i,j
2
Таким образом, SUM d = 14,00 + 28,75 + 5,00 + 8,75 = 56,50,
i,j
0
а так как в данном случае n = 4, k = 4, r = 2, r = 2, то по
формуле II.4.2 получаем:
56,50 - 4 x (5,125 + 2,125)
V = --------------------------- = 1,146.
4 x (16 - 8 - 2 - 2 + 2)
Данное испытание относится к типу 2;2, так что использование
соответствующего раздела табл. IV приложения вместе с формулами
II.3.4 - II.3.10 дает:
G = 219,0 - 230,75 - 221,50 + 232,75 = - 0,50;
---
V = 4 х 1,146 = 4,584; ЈGЈ / / V = 0,233 < 2,447
G / G
(t(95%, f) для f = (4 - 1)(4 - 2) = 6), поэтому одинаковость
наклонов двух дозовых прямых не отвергается; далее:
Е = (- 219,0 + 230,75 - 221,50 + 232,75) / 2 = 11,50;
F = (- 219,0 - 230,75 + 221,50 + 232,75) / 2 = 2,25;
2
A = V = 1,146; I = lg 200 - lg 100 = 0,301; B = V/I = 12,65;
0
b = 11,50/0,301 = 38,2; M = 2,25/38,2 = 0,0589; D /D = 114,5%;
2 2
g = 12,65 х 2,447 /38,2 = 0,052; 1 - g = 0,948;
0,0589
M = ------- +/-
H, B 0,948
--------------------------------
2,447 / 2
+/- ------------ / 1,146 х 0,948 + 12,65 х 0,0589 =
38,2 х 0,948
= 0,062 +/- 0,0718 = [- 0,0097; 0,1340];
0
(D /D) = 97,8%; 136,1%.
H, B
При проведении испытания по методу латинского квадрата потеря
отдельных результатов нарушает всю схему расчетов, поэтому
необходимо "заместить" их надлежащими оценками. Проще всего это
можно сделать, подставив на место выпавшего результата среднее из
оставшихся результатов для той же дозы того же препарата.
Применяемый в дисперсионном анализе более сложный способ оценки
выпавшего значения не дает в задаче определения эквивалентных доз
существенного повышения точности общих результатов испытания.
Таблица II.4.1
Љ”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””’”””””””’””””””’”””””’””””””Ї
Ј _ Ј Ј Ј Ј 2 Ј
Ј Результаты испытания, у ЈSUM у Ј у Ј d Ј d Ј
Ј ij Ј j ijЈ i Ј i Ј i Ј
“”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤
Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ју = 222 у = 229 у1 = 222 у2 = 235 Ј 908 Ј227,00Ј1,00 Ј1,0000Ј
Ј 1 2 Ј Ј Ј Ј Ј
“”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤
Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ју2 = 231 у = 217 у = 231 у1 = 220 Ј 899 Ј224,75Ј-1,25Ј1,5625Ј
Ј 1 2 Ј Ј Ј Ј Ј
“”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤
Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ју1 = 221 у2 = 233 у = 218 у = 228 Ј 900 Ј225,00Ј-1,00Ј1,0000Ј
Ј 1 2 Ј Ј Ј Ј Ј
Ј Ј Ј Ј Ј Ј
“”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””•””””””•”””””•””””””¤
Ј 0 0 Ј Ј Ј Ј Ј
Ју = 235 у1 = 223 у2 = 232 у = 219 Ј 909 Ј227,25Ј1,25 Ј1,5625Ј
Ј 2 1 Ј Ј Ј Ј Ј
“”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””•”””””””‘””””””‘”””””‘””””””¤
Ј Ј 2 Ј
ЈSUM у 909 902 903 902 Ј 3616 SUM d = 5,12 Ј
Ј i i,j Ј i i Ј
Ј Ј _ Ј
Ју 227,25 225,50 225,75 225,50Ј у = 226,00 Ј
Ј j Ј Ј
Јd 1,25 - 0,50 - 0,25 - 0,50Ј Ј
Ј j Ј Ј
Ј 2 Ј 2 Ј
Јd 1,5625 0,2500 0,0625 0,2500Ј SUM d = 2,125 Ј
Ј j Ј j j Ј
ђ”””””””””””””””””””””””””””””””””””””””‘”””””””””””””””””””””””””””‰
Таблица II.4.2
Љ”””””””’””””””’”””’””’””””””’””””””’”””””””’””””””’”””””’””””’””””””’””””””’””””””Ї
Ј Ј 0 Ј Ј 2Ј 0 Ј Ј 2 Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј 2 Ј
Ј Ј y Ј d Јd Ј y Ј d Ј d Ј y1 Ј d Ј d Ј y Ј d Ј d Ј
Ј Ј 1 Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј Ј Ј Ј 2 Ј Ј Ј
“”””””””•””””””•”””•””•””””””•””””””•”””””””•””””””•”””””•””””•””””””•””””””•””””””¤
Ј Ј 222 Ј 3 Ј9 Ј 229 Ј- 1,75Ј 3,0625Ј 222 Ј 0,5 Ј0,25Ј 235 Ј 2,25 Ј5,0625Ј
Ј Ј 217 Ј- 2Ј4 Ј 231 Ј 0,25Ј 0,0625Ј 220 Ј- 1,5Ј2,25Ј 231 Ј- 1,75Ј3,0626Ј
Ј Ј 218 Ј- 1Ј1 Ј 228 Ј- 2,75Ј 7,5625Ј 221 Ј- 0,5Ј0,25Ј 233 Ј 0,25 Ј0,0625Ј
Ј Ј 219 Ј 0 Ј0 Ј 235 Ј 4,25Ј18,0625Ј 233 Ј 1,5 Ј2,25Ј 232 Ј- 0,75Ј0,5625Ј
“”””””””•””””””•”””•””•””””””•””””””•”””””””•””””””•”””””•””””•””””””•””””””•””””””¤
ЈСумма Ј 876 Ј 0 Ј14Ј 923 Ј 0 Ј 28,75 Ј 886 Ј 0 Ј 5 Ј 931 Ј 0 Ј 8,75 Ј
ЈСреднееЈ219,00Ј Ј Ј230,75Ј Ј Ј221,50Ј Ј Ј232,75Ј Ј Ј
ђ”””””””‘””””””‘”””‘””‘””””””‘””””””‘”””””””‘””””””‘”””””‘””””‘””””””‘””””””‘””””””‰
////////////////////////////